【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种iso突变体、基因工程菌株及其在合成香兰素中的应用。
技术介绍
1、香兰素是世界上使用最广泛的调味品之一，各种食品中对香兰素作为调味剂的需求非常高。香兰素还具有抗菌和抗氧化特性，因此也被用作食品防腐剂或与壳聚糖/聚乙烯醇结合制备成活性薄膜用于食品包装。香兰素除了作为调味品、掩蔽剂被广泛应用外，由于其抗氧化、抗菌、抗炎、抗伤害、镇痛和抗癌等特性，使得它在药物生产中同样具有很大的需求量。生产高价值香兰素以满足快速增长的需求对食品、制药、化妆品和精细化工行业非常重要。
2、从香荚兰豆荚中提取的香兰素为天然制品，但原料香荚兰荚果的供应有限，该提取方法劳动强度大、加工周期长、制品的价格也十分昂贵，使得天然提取法获得的香兰素远远不能满足市场需求。化学合成法生产香兰素普遍存在副产物多且分离困难、生产过程会导致环境污染等问题。同时，相比于天然香兰素，化学合成的香兰素香型单一、品质较低，因而其售价也远低于天然香兰素。
3、由于天然提取法与化学合成法存在种种不足，致使人们越来越重视利用生物法合成香兰素，突破了植物提取法的局限，具有周期短、不受环境因素影响的优势，并避免了化学合成法的缺点，低能耗、低污染，得到的产品品质较好。
4、harmann等利用脂肪酶chirazyme催化底物异丁香酚和松柏醛，得到了质量分数分别为30.4％和83.1％的香兰素。有研究人员尝试在培养香荚兰气根组织时，加入阿魏酸作为底物，得到了0.7％(w/w)的香兰素。但以上方法存在难以控制的缺点，并且产
5、利用微生物转化天然原料生产的香兰素，被认可为天然的香兰素，用此方法得到的香兰素符合人们对健康食品的需求，也可以满足市场对天然香兰素的需求。自然界中存在许多菌株可以将阿魏酸、丁香酚和异丁香酚等物质转化为香兰素，对这些菌株进行发酵优化、基因工程改造等，从而研发一种新的可以实现香兰素产量提高的方法，具有产业化应用前景。
技术实现思路
1、针对上述不足，本专利技术提供了一种iso突变体、基因工程菌株及其在合成香兰素中的应用。酶的底物通道工程成为一种新兴的蛋白质工程策略，对酶底物结合口袋附近的氨基酸残基进行分子改造，可以改变该酶的底物特异性、区域选择性、立体选择性等，但目前很少有研究对远离酶口袋中心位点进行改造。本专利技术对4-乙烯基愈创木酚加氧酶iso的远离口袋中心的第27位、第77位、第91位、第139位、第156位、第227位、第417位、第434位中的任意一个或多个位点进行突变，获得能够高效催化阿魏酸通过两步酶法生成香兰素的基因工程菌株。利用所述基因工程菌株能够高效生成香兰素，100mmol/l底物浓度，香兰素转化率能够达到68.5-85.73％，产量能够达到10.41-13.03g/l，具有良好的工业应用前景。
2、
3、术语：
4、本专利技术中，术语“d27p”代表将第27位的天冬氨酸d突变为脯氨酸p。
5、本专利技术中，术语“h49f”代表将第49位的组氨酸h突变为苯丙氨酸f。
6、本专利技术中，术语“y77f”代表将第77位的酪氨酸y突变为苯丙氨酸f。
7、本专利技术中，术语“k91r”代表将第91位的赖氨酸k突变为精氨酸r。
8、本专利技术中，术语“g139a”代表将第139位的甘氨酸g突变为丙氨酸a。
9、本专利技术中，术语“y156d”代表将第156位的酪氨酸y突变为天冬氨酸d。
10、本专利技术中，术语“a227v”代表将第227位的丙氨酸a突变为缬氨酸v。
11、本专利技术中，术语“p408c”代表将第408位脯氨酸的p突变为半胱氨酸c。
12、本专利技术中，术语“h417f”代表将第417位组氨酸h突变为苯丙氨酸f。
13、本专利技术中，术语“d434y”代表将第434位的天冬氨酸d突变为酪氨酸y。
14、本专利技术的技术方案为：
15、一方面，本专利技术提供了一种iso突变体，所述的iso突变体包括对4-乙烯基愈创木酚加氧酶iso的远离口袋中心位点进行突变。
16、具体地，所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶iso的氨基酸序列如seq id no.1所示。
17、seq id no.1：
18、mpnypqtihfvglntpvgiewsarnldvigtipaeidgaffravpdpahppmfdddivlsgdgmvakfaihdgkvdyairyveteryrlekdarralfgqyrnpftddasvagrdrtvanttpvwhggrllmtkedglgyqvdpdtletlgrfdyygalksqtftahprvdpetgemfffgyeadglcstkisyaiadrdgkliseqwfdqpycstihdfaitehyaifpifpttadldrlkaggahwahqqdleswvgimprygkveemrwfkgrngvsafhlvnayeedgfvhldlclsdtnafgfmreaggiqrdqrdiqggltrwtfdlskegdmfeerlvgppgdmprlrdadqgrpyraawylsmnpqggpplpggpvgvafnallriepgngridmmglepgmaisepvhvpstqdehegwllmvvdrqageadfkselwvveagaiaagpiarvpmpmpmraqvhgawvsarqlanarqnvdseaa。
19、具体地，所述的远离口袋中心位点为seq id no.1的第27位、第77位、第91位、第139位、第156位、第227位、第417位、第434位中的任意一个或多个位点。
20、优选地，所述的突变包括将第27位的天冬氨酸d突变为脯氨酸p。
21、优选地，所述的突变包括将第77位的酪氨酸y突变为苯丙氨酸f。
22、优选地，所述的突变包括将第91位的赖氨酸k突变为精氨酸r。
23、优选地，所述的突变包括将第139位的甘氨酸g突变为丙氨酸a。
24、优选地，所述的突变包括将第156位的酪氨酸y突变为天冬氨酸d。
25、优选地，所述的突变包括将第227位的丙氨酸a突变为缬氨酸v。
26、优选地，所述的突变包括将第417位组氨酸h突变为苯丙氨酸f。
27、优选地，所述的突变包括将第434位的天冬氨酸d突变为酪氨酸y。
28、优选地，所述的iso突变体包括：
29、(1)将第27位的天冬氨酸d突变为脯氨酸p的突变体d27p；或
30、(2)将第77位的酪氨酸y突变为苯丙氨酸f的突变体y77f；或
31、(3)将第91位的赖氨酸k突变为精氨酸r的突变体k91r；或
32、(4)将第139位的甘氨酸g突变为丙氨酸a的突变体g139a；或
33、(5)将第15本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Iso突变体，其特征在于，所述的Iso突变体包括对4-乙烯基愈创木酚加氧酶Iso的远离口袋中心位点进行突变；
2.根据权利要求1所述的Iso突变体，其特征在于，所述的Iso突变体具有如SEQ IDNO.2-9所示的氨基酸序列。
3.一种Iso突变体基因工程菌株，其特征在于，所述的Iso突变体基因工程菌株过表达权利要求1-2任一项所述的Iso突变体。
4.根据权利要求3所述的Iso突变体基因工程菌株，其特征在于，所述的Iso突变体基因工程菌株以大肠杆菌为宿主，异源过表达Iso突变体。
5.权利要求1-2任一项所述的Iso突变体或权利要求3-4任一项所述的Iso突变体基因工程菌株在催化阿魏酸合成香兰素中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的Iso突变体或Iso突变体基因工程菌株催化4-乙烯基愈创木酚生成香兰素。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用还包括使用阿魏酸脱羧酶Bpf或其基因工程菌株。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的阿魏酸脱羧酶Bp
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的阿魏酸脱羧酶Bpf或其基因工程菌株催化阿魏酸生成4-乙烯基愈创木酚。
10.一种合成香兰素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种iso突变体，其特征在于，所述的iso突变体包括对4-乙烯基愈创木酚加氧酶iso的远离口袋中心位点进行突变；
2.根据权利要求1所述的iso突变体，其特征在于，所述的iso突变体具有如seq idno.2-9所示的氨基酸序列。
3.一种iso突变体基因工程菌株，其特征在于，所述的iso突变体基因工程菌株过表达权利要求1-2任一项所述的iso突变体。
4.根据权利要求3所述的iso突变体基因工程菌株，其特征在于，所述的iso突变体基因工程菌株以大肠杆菌为宿主，异源过表达iso突变体。
5.权利要求1-2任一项所述的iso突变体或权利要求3-4任一项所述的iso突变体基因工程菌株在催化阿魏酸合成香兰素...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴冬，成丽丽，侯丽丽，朱书杰，代陈胜，朱敏，郝子文，步依繁，郑良振，王晟，
申请(专利权)人：上海智峪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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