【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物代谢工程及工业生物，涉及一种木质纤维素高效利用生产脂肪酸和3-羟基丙酸的工程菌及其构建方法和促进葡萄糖、木糖共利用生产脂肪酸和3-羟基丙酸中的应用。
技术介绍
1、木质纤维素作为第2代生物炼制原料，在自然界中广泛存在。木质纤维素的来源、预处理、生物转化和目标产物产量等因素决定着纤维素生物炼制的效率和收益，其中高效共利用纤维素水解液中的混合糖是降低生产成本的关键因素之一。
2、纤维素生物炼制需要高效共利用六碳糖(葡萄糖)和五碳糖(木糖)，尤其是对木糖的利用效率至关重要。然而，由于木糖利用效率低以及葡萄糖抑制效应，改造微生物实现葡萄糖和木糖的共利用具有一定的难度，例如在模式菌株酿酒酵母中通过增强木糖同化以及改造木糖转运强化木糖利用效率，但木糖利用依然受到葡萄糖的抑制。因此，天然的木糖利用菌，如多形汉逊酵母，可能成为葡萄糖和木糖共利用的优良宿主。多形汉逊酵母具有诸多优点：1、耐高温(最高可耐50℃)，使其适合木质纤维素的同步糖化发酵过程，降低冷却成本和染菌风险；2、其属于crabtree阴性酵母，发酵过程不会积累乙醇，容易实现高密度发酵和产物的高得率。因此，多形汉逊酵母常用于重组蛋白的生产，现在也逐渐用于化学品的合成。
3、尽管多形汉逊酵母能够天然利用木糖，但是其木糖利用效率较低，主要表现为延滞期较长，影响了产物合成效率，降低了产物生产强度。更为重要的是，由于较低的木糖利用效率，在葡萄糖和木糖混合培养基中，葡萄糖会严重抑制木糖利用，进一步导致发酵时间延长以及碳源浪费。因此，需要系统改造细胞代
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是酵母利用木质纤维素原料时存在的木糖利用效率低、葡萄糖抑制效应以及脂肪酸和3-羟基丙酸合成效率低等问题，进而提出一种木质纤维素高效利用生产脂肪酸和3-羟基丙酸的工程菌及其构建方法和促进葡萄糖、木糖共利用生产脂肪酸和3-羟基丙酸中的应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：
3、一种木质纤维素高效利用的工程菌，以多形汉逊酵母为出发菌株强化前体乙酰-coa和辅因子nadph供应，并改造木糖代谢获得重组菌株。
4、以多形汉逊酵母野生型菌株ncyc 495出发菌株，敲除faa1和pex10基因，过表达fbp1和zwf1基因，即获得重组菌株。
5、一种木质纤维素高效利用的工程菌的构建方法，以多形汉逊酵母野生型菌株ncyc495出发菌株，依次敲除脂肪酸β-氧化途径的长链脂酰-coa连接酶基因(faa1)、过氧化物酶体相关基因(pex10)，进而增强脂肪酸前体乙酰-coa的供应，而后过表达糖异生途径的果糖-1,6-二磷酸1-磷酸酶基因(fbp1)和氧化磷酸戊糖途径的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(zwf1)增强脂肪酸辅因子nadph的供应，即获得重组菌株。
6、进一步的说，首先构建crispr/cas9系统，通过融合pcr方法获得重组片段pgap-hcas9-taox1，启动子pgap和终止子taox1以多形汉逊酵母基因组为模板pcr扩增获得，人源cas9基因以质粒pcas9为模板pcr扩增获得，用重叠延伸pcr(oe-pcr)方法将上述片段融合获得重组片段，将重组片段500ng电击转化多形汉逊酵母野生型菌株ncyc 495，通过单交换整合到多形汉逊酵母基因组中，获得表达cas9蛋白的多形汉逊酵母菌株495-3。然后，敲除faa1使脂肪酸积累，以多形汉逊酵母基因组为模板pcr扩增获得faa1基因开放阅读框(orf)上游同源臂faa1up和下游同源臂faa1dw，用oe-pcr方法将上述片段融合获得faa1基因敲除的donor dna，以500ng donor dna和500ng faa1grna质粒一起电击转化多形汉逊酵母野生型菌株495-3，涂布到sd+leu2筛选平板于37℃静置培养3～4天，转化子经液体ypd培养基培养后，通过菌落pcr验证正确，涂布于ypd平板进行质粒丢失，菌株保存备用，获得工程菌hpfa10，下文中多形汉逊酵母其它基因组编辑工作均遵循相似流程。敲除过氧化物酶体相关基因pex10增强乙酰-coa的供应，以多形汉逊酵母基因组为模板pcr扩增获得pex10基因orf上游同源臂pex10up和下游同源臂pex10dw，用oe-pcr方法将上述片段融合获得pex10基因敲除的donor dna，以500ng donor dna和500ng pex10grna质粒一起电击转化多形汉逊酵母野生型菌株hpfa10，获得工程菌hpfa17。过表达fbp1和zwf1基因增强辅因子nadph的供应，以多形汉逊酵母基因组为模板pcr扩增获得中性位点ns2上下游同源臂ns2up和ns2dw、启动子padh1和ppma1、基因fbp1和zwf1以及终止子tcat1和tgap，用oe-pcr方法将上述片段融合获得donor dna片段：ns2up-tcat1-zwf1-padh1+ppma1-fbp1-tgap-ns2dw，以500ng donor dna和500ng ns2grna质粒一起电击转化多形汉逊酵母野生型菌株hpfa17，获得工程菌hpfa40。以葡萄糖为底物发酵，气相色谱(gc)测定脂肪酸产量达到30g/l。
7、一种木质纤维素高效利用的工程菌，利用上述强化前体乙酰-coa的菌株作为出发菌株，依次过表达己糖转运蛋白突变体基因(hxt1n358a_k)、来源于梨囊鞭菌piromyces sp.的木糖异构酶基因(pspxi*)和多形汉逊酵母的木酮糖激酶基因(xyl3)，进而获得实现葡萄糖和木糖的同步利用的重组菌株。
8、所述hxt1n358a_k基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述pspxi*基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9、进一步的说，于上述获得重组菌株的基础上回补筛选标记ura3基因和leu2基因，获得重组菌株hpfa58。
10、一种木质纤维素高效利用的工程菌的构建方法，运用crispr-cas9基因编辑技术，在出发菌株pex10基因位点整合组成型启动子ppgd1控制的hxt1*基因，即pex10δ∷(ppgd1-hxt1*-thxt1)；在ns12中性位点整合组成型启动子pgap控制的pspxi*基因，即ns12∷(pgap-pspxi*-txyl1)；以及在pox1基因位点整合组成型启动子ppma1控制的xyl3基因，即pox1δ∷(ppma1-xyl3-taxo1)；而后即得实现葡萄糖和木糖的同步利用的重组菌株。
11、进一步的说，首先，在pox1位点整合xyl3基因，以多形汉逊酵母基因组为模板pcr扩增获得pox1基因orf上下游同源臂pox1up和pox1dw、启动子ppma1、终止子thxt1和基因xyl3，用oe-pcr方法将上述片段融合获得整合xyl3的donor dna：pox1up-ppma1-xyl3-taxo1-pox1dw本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种木质纤维素高效利用的工程菌，其特征在于：以多形汉逊酵母为出发菌株强化前体乙酰-CoA和辅因子NADPH供应，并改造木糖代谢获得重组菌株。
2.按权利要求1所述的木质纤维素高效利用的工程菌，其特征在于：以多形汉逊酵母野生型菌株NCYC 495出发菌株，敲除FAA1和PEX10基因，过表达FBP1和ZWF1基因，即获得重组菌株。
3.一种权利要求1所述的木质纤维素高效利用的工程菌的构建方法，其特征在于：以多形汉逊酵母野生型菌株NCYC 495出发菌株，依次敲除脂肪酸β-氧化途径的长链脂酰-CoA连接酶基因(FAA1)、过氧化物酶体相关基因(PEX10)，进而增强脂肪酸前体乙酰-CoA的供应，而后过表达糖异生途径的果糖-1,6-二磷酸1-磷酸酶基因(FBP1)和氧化磷酸戊糖途径的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(ZWF1)增强脂肪酸辅因子NADPH的供应，即获得重组菌株。
4.一种木质纤维素高效利用的工程菌，其特征在于：利用权利要求1中强化前体乙酰-CoA的菌株作为出发菌株，依次过表达己糖转运蛋白突变体基因(HXT1N358A_K)、来源于梨囊鞭菌
5.按权利要求4所述的木质纤维素高效利用的工程菌，其特征在于：所述HXT1N358A_K基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述PspXI*基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
6.一种权利要求4所述的木质纤维素高效利用的工程菌的构建方法，其特征在于：运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在出发菌株PEX10基因位点整合组成型启动子PPGD1控制的HXT1*基因，即pex10Δ∷(PPGD1-HXT1*-THXT1)；在NS12中性位点整合组成型启动子PGAP控制的PspXI*基因，即NS12∷(PGAP-PspXI*-TXYL1)；以及在POX1基因位点整合组成型启动子PPMA1控制的XYL3基因，即pox1Δ∷(PPMA1-XYL3-TAXO1)；而后即得实现葡萄糖和木糖的同步利用的重组菌株。
7.一种木质纤维素高效利用的工程菌，其特征在于：以权利要求4中过表达来源于梨囊鞭菌Piromyces Sp.的木糖异构酶基因(PspXI*)后的菌株为出发菌株，在PEX10基因位点整合组成型启动子PPGD1控制的HXT1*基因，即pex10Δ∷(PPGD1-HXT1*-THXT1)；在NS2中性位点整合基因ZWF1和FBP1，即NS2∷(TCAT1-ZWF1-PADH1+PPMA1-FBP1-TGAP)；同时，通过原位回补FAA1基因，并过表达来源于橙色绿屈挠菌Chloroflexus aurantiacus的丙二酰-CoA还原酶基因(MCR)，即获得重组菌株。
8.按权利要求7所述的木质纤维素高效利用的工程菌，其特征在于：所述MCR基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
9.一种权利要求7所述的木质纤维素高效利用的工程菌的构建方法，其特征在于：运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在出发菌株PEX10基因位点整合组成型启动子PPGD1控制的HXT1*基因，即pex10Δ∷(PPGD1-HXT1*-THXT1)；在NS2中性位点整合基因ZWF1和FBP1，即NS2∷(TCAT1-ZWF1-PADH1+PPMA1-FBP1-TGAP)；通过替换FAA1终止子为ADH1终止子的同时引入FAA1基因的ORF，然后在4NS7中性位点整合组成型启动子PGAP控制的MCR基因，即获得重组菌株。
10.一种权利要求1、4或7所述的木质纤维素高效利用的工程菌的应用，其特征在于：所述工程菌在共利用葡萄糖和木糖生产脂肪酸和3-羟基丙酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种木质纤维素高效利用的工程菌，其特征在于：以多形汉逊酵母为出发菌株强化前体乙酰-coa和辅因子nadph供应，并改造木糖代谢获得重组菌株。
2.按权利要求1所述的木质纤维素高效利用的工程菌，其特征在于：以多形汉逊酵母野生型菌株ncyc 495出发菌株，敲除faa1和pex10基因，过表达fbp1和zwf1基因，即获得重组菌株。
3.一种权利要求1所述的木质纤维素高效利用的工程菌的构建方法，其特征在于：以多形汉逊酵母野生型菌株ncyc 495出发菌株，依次敲除脂肪酸β-氧化途径的长链脂酰-coa连接酶基因(faa1)、过氧化物酶体相关基因(pex10)，进而增强脂肪酸前体乙酰-coa的供应，而后过表达糖异生途径的果糖-1,6-二磷酸1-磷酸酶基因(fbp1)和氧化磷酸戊糖途径的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(zwf1)增强脂肪酸辅因子nadph的供应，即获得重组菌株。
4.一种木质纤维素高效利用的工程菌，其特征在于：利用权利要求1中强化前体乙酰-coa的菌株作为出发菌株，依次过表达己糖转运蛋白突变体基因(hxt1n358a_k)、来源于梨囊鞭菌piromyces sp.的木糖异构酶基因(pspxi*)和多形汉逊酵母的木酮糖激酶基因(xyl3)，进而获得实现葡萄糖和木糖的同步利用的重组菌株。
5.按权利要求4所述的木质纤维素高效利用的工程菌，其特征在于：所述hxt1n358a_k基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述pspxi*基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6.一种权利要求4所述的木质纤维素高效利用的工程菌的构建方法，其特征在于：运用crispr-cas9基因编辑技术，在出发菌株pex10基因位点整合组成型启动子ppgd1控制的hxt1*基因，即pex10δ∷(ppgd1-hxt1*-thxt1)；在ns12中性位点整合组成型启动子pga...
【专利技术属性】
技术研发人员：周雍进，高教琪，禹伟，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。