【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种酰基转移酶突变体及其应用。
技术介绍
1、辛伐他汀是目前国内外最畅销的降脂药之一，可用于控制血液中胆固醇含量及预防心血管疾病，其药理作用是作为竞争性抑制剂抑制胆固醇合成的限速酶：3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶的活性，从而降低胆固醇的生物合成。作为洛伐他汀的半合成衍生物，与相同剂量的洛伐他汀相比，辛伐他汀可以更有效地降低血清中的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，使血清中tc、ldl-c、vldl-c水平下降，为血脂调节剂，可用于治疗高血脂症与冠心病。
2、辛伐他汀的合成方法较多，其中国内工业化生产使用最多的路线还是化学合成法，以及新开发出的生物合成法。就两种合成方法而言，化学法生产辛伐他汀有着反应条件苛刻、副反应多、产品分离纯化困难等一些缺点，生物合成法有明显优势，具有反应时间短、反应条件温和、经济效益较好的优点。
3、生物酶法合成法的路线是洛伐他汀经开环在水解酶作用下生成莫那可林j，莫那可林j与侧链在酰基转移酶作用下生成辛伐他汀铵盐，辛伐他汀铵盐经酸催化环合反应后生成辛伐他汀粗品，精制后得辛伐他汀成品。野生的酰基转移酶能催化上述反应，但效率很低，故需要投入极大量的酶进行催化反应，且用时较长。并且，由于野生酰基转移酶的活力低，需要对发酵产生的洛伐他汀原料进行精制才能投入后继反应，过于繁琐的操作步骤也限制了酶法的实际应用。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种酰基转移酶突变体及其应用，该酰基转移
2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现：
3、本专利技术一方面提供了一种酰基转移酶突变体，所述突变体与seq id no.1的野生型土曲霉酰基转移酶氨基酸序列相比，存在突变位点，所述突变位点包括如下突变位点i4s、d12n、d262g、y327h、a75v、a306t、i369v、g183d、m319t、e353k中的一个或多个突变。
4、进一步的，i4s突变代表第4位由异亮氨酸突变为丝氨酸；d12n突变代表第12位由天冬氨酸突变为天冬酰胺；d262g突变代表第262位由天冬氨酸突变为甘氨酸；y327h突变代表第327位由酪氨酸突变为组氨酸；a75v突变代表第75位由丙氨酸突变为缬氨酸；a306t突变代表第306位由丙氨酸突变为苏氨酸；i369v突变代表第369位由异亮氨酸突变为缬氨酸；g183d突变代表第183位由甘氨酸突变为天冬氨酸；m319t突变代表第319位由甲硫氨酸突变为苏氨酸；e353k突变代表第353位由谷氨酸突变为赖氨酸。
5、进一步优选的，所述突变体与seq id no.1的野生型土曲霉酰基转移酶氨基酸序列相比，存在突变位点，所述突变位点包括如下突变位点d12n、d262g、a75v、a306t、g183d、m319t、e353k中的一个或多个突变。
6、进一步优选的，所述突变体与seq id no.1的野生型土曲霉酰基转移酶氨基酸序列相比，存在突变位点，所述突变位点包括如下突变位点a75v、g183d、e353k中的一个或多个突变。
7、本专利技术另一方面提供一种编码基因，其编码以上所述的酰基转移酶突变体。
8、本专利技术还提供了一种重组质粒，该重组质粒连接有以上所述的编码基因。
9、本专利技术还提供了一种重组细胞，该重组细胞包含有以上所述的编码基因或重组质粒。
10、一种制备酰基转移酶突变体的方法，包括如下步骤：
11、构建野生型酰基转移酶表达载体，通过随机突变和高通量筛选获得突变体；
12、以野生型土曲霉酰基转移酶表达载体为模板，根据待突变的氨基酸及目标氨基酸位点设计含有筛选出的突变体的突变位点的引物，采用mega whop pcr方法，构建酰基转移酶突变体表达载体；
13、将得到的酰基转移酶突变体表达载体转化至宿主细胞中，获得酰基转移酶表达菌株；
14、将获得的酰基转移酶表达菌株的单个微生物菌落接种于lb培养基中活化后，再转入tb培养基中进行培养，收集菌体细胞，破碎后得到酰基转移酶突变体。
15、该酰基转移酶突变体应用于催化合成辛伐他汀。
16、与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
17、本专利技术通过随机突变和高通量筛选获得酰基转移酶的i4s、d12n、d262g、y327h、a75v、a306t、i369v、g183d、m319t、e353k突变，使获得的含有其中一个或多个突变位点的酶突变体具有较高的酰基转移酶活性，在mja和提供酰基供体的α-二甲基丁酰硫酯合成辛伐他汀的生产过程中，能有效降低工业化生产成本，简化生产步骤，具有很好的工业应用前景。
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1.一种酰基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体与SEQ ID NO.1的野生型土曲霉酰基转移酶氨基酸序列相比，存在突变位点，所述突变位点包括如下突变位点I4S、D12N、D262G、Y327H、A75V、A306T、I369V、G183D、M319T、E353K中的一个或多个突变。
2.根据权利要求1所述的一种酰基转移酶突变体，其特征在于，I4S突变代表第4位由异亮氨酸突变为丝氨酸；D12N突变代表第12位由天冬氨酸突变为天冬酰胺；D262G突变代表第262位由天冬氨酸突变为甘氨酸；Y327H突变代表第327位由酪氨酸突变为组氨酸；A75V突变代表第75位由丙氨酸突变为缬氨酸；A306T突变代表第306位由丙氨酸突变为苏氨酸；I369V突变代表第369位由异亮氨酸突变为缬氨酸；G183D突变代表第183位由甘氨酸突变为天冬氨酸；M319T突变代表第319位由甲硫氨酸突变为苏氨酸；E353K突变代表第353位由谷氨酸突变为赖氨酸。
3.根据权利要求1所述的一种酰基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体与SEQ IDNO.1的野生型土曲霉酰基转移酶氨基酸序列相
4.根据权利要求1所述的一种酰基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体与SEQ IDNO.1的野生型土曲霉酰基转移酶氨基酸序列相比，存在突变位点，所述突变位点包括如下突变位点A75V、G183D、E353K中的一个或多个突变。
5.一种编码基因，其编码权利要求1-4任一项所述的酰基转移酶突变体。
6.一种重组质粒，该重组质粒连接有权利要求5所述的编码基因。
7.一种重组细胞，该重组细胞包含有权利要求5所述的编码基因或权利要求6所述的重组质粒。
8.一种制备权利要求1-4任一项所述的酰基转移酶突变体的方法，包括如下步骤：
9.权利要求1～4任一项所述的酰基转移酶突变体应用于催化合成辛伐他汀。
...【技术特征摘要】
1.一种酰基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体与seq id no.1的野生型土曲霉酰基转移酶氨基酸序列相比，存在突变位点，所述突变位点包括如下突变位点i4s、d12n、d262g、y327h、a75v、a306t、i369v、g183d、m319t、e353k中的一个或多个突变。
2.根据权利要求1所述的一种酰基转移酶突变体，其特征在于，i4s突变代表第4位由异亮氨酸突变为丝氨酸；d12n突变代表第12位由天冬氨酸突变为天冬酰胺；d262g突变代表第262位由天冬氨酸突变为甘氨酸；y327h突变代表第327位由酪氨酸突变为组氨酸；a75v突变代表第75位由丙氨酸突变为缬氨酸；a306t突变代表第306位由丙氨酸突变为苏氨酸；i369v突变代表第369位由异亮氨酸突变为缬氨酸；g183d突变代表第183位由甘氨酸突变为天冬氨酸；m319t突变代表第319位由甲硫氨酸突变为苏氨酸；e353k突变代表第353位由谷氨酸突变为赖氨酸。
3.根据权利要求1所述的一种酰基转移...
【专利技术属性】
技术研发人员：余宏，姚明珠，王波，钱晓东，
申请(专利权)人：苏州诺恩斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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