【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种构建生物材料的方法，尤其是涉及一种唾液腺分泌性癌类器官，及其培养方法和培养基。
技术介绍
1、唾液腺分泌性癌(salivary secretory carcinoma，ssc)是一种较罕见、独特的唾液腺肿瘤新类型，在2017年who头颈部肿瘤分类中收录为唾液腺肿瘤的一个独立病种。近年来，随着ssc的报道逐渐增多，ssc的研究逐渐成为热点。目前认为ssc是一种低度恶性的唾液腺肿瘤，可伴有高级别(high grade，hg)转化，并出现侵袭性生长、易复发、转移及预后较差等特点。其主要治疗方式为手术切除，配合术后适量的放、化疗。ssc因其在临床上、影像学上和组织学上并不具有特异性，且缺乏特异性的抗体，所以在病理诊断中易将其诊断为腺泡细胞癌、黏液表皮样癌及腺样囊性癌等。
2、近年来，为寻找ssc的高效治疗方法，已经出现了一些针对ssc的靶向治疗药物。但对于靶点的寻找，存在技术局限和临床前模型缺乏等问题，尤其是保留患者肿瘤遗传学背景和生物行为学特性的人源性模型(pdx和类器官等)，则对ssc的研究造成了些许阻碍。
3、类器官(organoids)是一种由人源性器官特异性的成体干细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化、自我组合而成的3d细胞簇，能再现组织和器官的某些特性和功能。它可以和其他的生物技术整合，包括但不限于基因编辑、单细胞基因组学和微流体技术等，提供了一种对疾病的发病机制、发展过程和新的诊断和治疗技术等加以研究的方式。研究人员模拟各种组织类型构建了多种类器官，但ssc的类器官建立存在难度，还
技术实现思路
1、本专利技术的一个目的在于提供一种类器官，从唾液腺分泌性癌组织分离和培养而得，利于研究唾液腺分泌性癌。
2、本专利技术的另一个目的在于提供一种培养唾液腺分泌性癌类器官的方法，以获得传代稳定的类器官。
3、本专利技术的再一个目的在于提供一种培养基，用于唾液腺分泌性癌类器官的培养，以获得传代稳定的类器官。
4、本专利技术的又一个目的在于提供一种类器官在制备治疗唾液腺分泌性癌药物中的应用。
5、本专利技术的第五个目的在于提供一种类器官在制备治疗唾液腺分泌性癌医疗器械中的应用。
6、一种类器官，从唾液腺分泌性癌组织中分离和培养获得，2024年5月14日保藏于中国武汉市中国典型培养物保藏中心(cctcc)，位于湖北省武汉市武昌区八一路299号(邮编：430072)，保藏号cctcc no c2024151，分类命名为homo sapiens。
7、构建本专利技术的类器官，包括从ssc肿瘤中取得单细胞悬液，培养类器官和类器官传代培养。
8、本专利技术的类器官按如下方法培养：
9、对分离的ssc组织进行消化，取得单细胞悬液；
10、计数板计数，根据计数结果加入培养基重悬细胞沉淀，与基质胶(低生长因子型matrigel，corning公司)1∶1混合(每40μl基质胶混合物中约含104个细胞)，接种于容器(如：24孔板，每孔加入40μl)中，
11、将接种了细胞的容器倒置于培养箱中(温度如：37℃，co2)，待基质胶凝固后，再次翻转容器，并加培养基(如：450μl±50μl)，
12、之后每2-3天更换一次培养基，以培养获得类器官。
13、观察类细胞的生长情况，根据对类器官数量的需要，进行传代，采用取1个容器分成6个容器的量比原则(1∶6)进行传代培养。若以24孔板实施，则每1个孔作为一个容器，方法如下：
14、弃去培养液，加入4℃pbs清洗(如：2次)，容器中加入4℃clutrextm类器官收获液，孵育30～90min，适当振摇容器，孵育结束时，加入基质胶，可见类器官漂浮于容器底，并将其转移至离心管(如：15ml)，离心(如：500×g，3min)，弃上清；
15、接着，pbs清洗(如：2次)，离心，弃上清，加入trypletm express酶，吹打均匀，37℃培养箱中静置，(显微镜下观察)细胞分离情况，当大部分(比如：50％及以上)类器官解离为单细胞时，终止消化(如：加入含10％胎牛血清的dmem培养液)，转移至离心管(如：15ml)，离心(如：500×g，3min)，弃上清；
16、之后，用类器官培养液重悬沉淀，与基质胶混合，重新接种于容器(如：40μl/孔)，于培养箱(如：37℃)静置(如：15～30min)，待基质胶凝固后，容器中加入类器官培养基(如：每孔500μl)，培养箱培养。
17、本专利技术不仅成功构建ssc的类器官模型，还提供了一种适合ssc类器官的培养基。
18、一种用于本专利技术类器官的培养基，包括：
19、advanced dmem/f12为基础培养基，还含有1％的抗霉素a、1％的glutamax、1％hepes缓冲液以及特异性添加因子组成。
20、特异性生长因子如：成纤维生长因子10(fgf-10)、表皮生长因子(egf)、成纤维生长因子2(fgf-2)、tgf-βi型受体抑制剂a83-01、wnt3a重组蛋白、noggin重组蛋白、r-spondin-1重组蛋白、n-乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine,nac)、烟酰胺、1×b27补充剂、抗生素primocintm、rho相关蛋白激酶(rho-associated kinases,rock)抑制剂y27632、地塞米松、胎牛血清(fbs)、chir 99021(糖原合酶激酶-3(gsk-3)抑制剂)、前列腺素e2和佛司可林(forskolin)等。这些物质单独或组合应用于本专利技术。
21、各个特异性生长因子的含量如：50-150ng/ml fgf-10、25-75ng/ml egf、1-10ng/ml fgf-2、0.05-0.2μmol/ml a83-01、500ng/ml wnt3a重组蛋白、0.05-0.2μg/ml noggin重组蛋白、0.05-0.2μg/ml r-spondin-1重组蛋白、0.5-2mmol/ml nac、5-15mmol/ml烟酰胺、1×b27补充剂(1∶25-100)、0.5-2mg/ml抗生素primocintm、5-15μmol/l y27632、0.5-2μmmol/l地塞米松、1-5v/v％fbs、0.1-0.4μmol/l chir 99021、0.5-2μmol/l前列腺素e2和0.5-2μmol/l forskolin等。
22、优选的，各个特异性生长因子的含量为：100ng/ml fgf-10、50ng/ml egf、5ng/mlfgf-2、0.1μmol/ml a83-01、500ng/ml wnt3a重组蛋白、0.05-0.2μg/ml noggin重组蛋白、0.05-0.2μg/ml r-spondin-1重组蛋白、0.1mmol/ml nac、1mmol/ml烟酰胺、1×b27补充剂(1∶50)、1mg/ml抗生素p本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种类器官，其特征在于从唾液腺分泌性癌组织中分离和培养获得，保藏号CCTCCNo C2024151。
2.一种从唾液腺分泌性癌组织中构建类器官的方法，其特征在于包括从SSC肿瘤中取得单细胞悬液，培养类器官和类器官传代培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述培养类器官包括步骤如下：
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于观察类细胞的生长情况，根据对类器官数量的需要，进行传代，采用取1个容器分成6个容器的量比进行传代培养。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的传代方法如下：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于加入含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于培养所述类器官的培养基以AdvancedDMEM/F12为基础培养基，还含有1％的抗霉素A、2mmol/ml的GlutaMAX、HEPES缓冲液10mmol/ml。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的培养基还包括特异性添加因子，选自于成纤维生长因子10、表皮生长因子
9.一种类器官，其特征在于以权利要求2所述的方法制得。
10.根据权利要求1或9所述的类器官在制备治疗唾液腺分泌性癌药物或医疗器械中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种类器官，其特征在于从唾液腺分泌性癌组织中分离和培养获得，保藏号cctccno c2024151。
2.一种从唾液腺分泌性癌组织中构建类器官的方法，其特征在于包括从ssc肿瘤中取得单细胞悬液，培养类器官和类器官传代培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述培养类器官包括步骤如下：
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于观察类细胞的生长情况，根据对类器官数量的需要，进行传代，采用取1个容器分成6个容器的量比进行传代培养。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的传代方法如下：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于加入含10％胎牛血清的dmem培养液终止消化。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于培养所述类器官的培养基以ad...
【专利技术属性】
技术研发人员：李江，顾挺，陈宛灵，田臻，石超吉，周榕，王敏，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：
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