【技术实现步骤摘要】
本专利技术是关于生物制药技术，特别是关于一种双特异性抗体蛋白层析纯化方法。
技术介绍
1、双特异性抗体(bispecific antibody，bsab，简称双抗)是指能同时特异性结合两个抗原或抗原表位的人工抗体。其能将效应细胞直接靶向肿瘤细胞以增强其细胞毒性、提高抗体选择性和功能性、共刺激或抑制受体。相对单抗，双抗具备更强特异性、靶向性，可以降低脱靶毒性；相较单抗的组合疗法，也可有效降低治疗成本等。由于拥有独特的生物学机理，双特异性抗体已经成为抗体药物研发领域的一个重要分支，也是当下制药行业最热门的研发和投资方向之一。
2、然而在其飞速发展的同时，也面临着一系列难题，其中包括制备工艺。如非对称的kih双抗结构通常由两条不同的重链和轻链(或两条不同的重链和相同的轻链)组成，因此在组装过程中很容易出现多种由于错配而产生的杂质，而且由于这些杂质往往与我们的目标结构理化性质相似而难以被去除；而一些对称的双抗结构又由于引入了额外的构型(如scfv)经常会产生聚集或者片段等问题。此外，宿主细胞蛋白(host cell protein，hcp)残留和宿主细胞dna(host cell dna，hcd)残留等通过纯化也均应达到其质量标准的要求。与单抗药物相比，双抗药物的副产物纷繁复杂，不存在通用型的纯化工艺，需针对不同类型的双抗，设计复杂多样的分离纯化工艺。复杂的纯化工艺会带来收率低，操作难度大等问题，且现有的纯化工艺手段有限。
3、双抗蛋白表达过程中杂质含量较多，目的蛋白表达量较低，分子疏水性强，且蛋白稳定性较差。很
4、公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种双特异性抗体蛋白层析纯化方法。
2、为实现上述目的，本专利技术的实施例提供了双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，包括
3、a、亲和填料预先经过平衡液平衡，将含有目的蛋白的第一料液加载在亲和填料上使目的蛋白与亲和填料结合，后经过洗杂、淋洗，然后采用洗脱液洗脱目的蛋白得到第一收集液；
4、b、准备层析组件，层析组件经过预平衡、平衡、上样、后平衡，收集流穿液以收集目的蛋白，其中上样为将第一收集液调制的第二料液加载到层析组件；
5、层析组件至少包括若干单元组件，单元组件为阴离子单元与羟基磷灰石层析柱串联，阴离子单元选自阴离子层析膜、阴离子层析柱、复合阴离子层析柱。
6、在本专利技术的一个或多个实施方式中，步骤b中层析组件中具有多个单元组件时，单元组件之间具有串联结构和/或并联结构。
7、在本专利技术的一个或多个实施方式中，步骤b中阴离子单元的配基包含季氨基。
8、在本专利技术的一个或多个实施方式中，步骤b中上样时的上样载量为100-300mg/ml，保留时间≥3min。优选的，上样载量为100-200mg/ml，保留时间≥5min。
9、在本专利技术的一个或多个实施方式中，步骤b中预平衡使用的预平衡缓冲液为20mmpb、1m氯化钠，ph6.5-7.5。优选的，预平衡缓冲液用量为3～5个柱体积倍量(柱体积倍量即相较于羟基磷灰石层析柱的体积倍数)。
10、在本专利技术的一个或多个实施方式中，步骤b中上样中，第二料液满足：20mm pb、ph6.5-7.5，电导10.0-30.0ms/cm。优选的，20mm pb、ph6.8-7.2，电导10.0-20.0ms/cm。
11、在本专利技术的一个或多个实施方式中，步骤b中平衡和/或后平衡所采用的缓冲液为：20mm pb,100～400mm氯化钠，ph6.5-7.5。优选的，缓冲液用量为3～5个柱体积倍量(柱体积倍量即相较于羟基磷灰石层析柱的体积倍数)。
12、在本专利技术的一个或多个实施方式中，步骤a中亲和填料选自：mabselect sure lx、mabselec prisma、nmab pro、nmab、unimab 50hc proteina、unimab 50proteina、atproteinadiamond、at proteinadiamond plus、at proteinadiamond plus、novo-adiamond、extrem adiamond、capto l、protein g。
13、在本专利技术的一个或多个实施方式中，步骤a中上样时的上样载量为≤50mg/ml，保留时间≥3min。优选的，上样载量为≤50mg/ml，保留时间≥5min。
14、在本专利技术的一个或多个实施方式中，步骤a中平衡和/或洗脱所采用的缓冲液含有5-50mm磷酸盐。优选的，缓冲液含有5-20mm磷酸盐，缓冲液用量为3～5个柱体积倍量(柱体积倍量即相较于亲和填料的体积倍数)。
15、在本专利技术的一个或多个实施方式中，步骤a中洗脱液为助剂浓度为20～200mm的缓冲液，助剂选自：甘氨酸-盐酸、醋酸钠-醋酸、柠檬酸钠-柠檬酸。
16、与现有技术相比，根据本专利技术实施方式的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，在选定的层析条件下，采用阴离子层析与羟基磷灰石层析串联的单元结构组合手段，可以实现高流速，高收率，高纯度的工艺表现，减少了工艺步骤，降低生产成本。
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1.一种双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，包括
2.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤B中所述层析组件中具有多个单元组件时，单元组件之间具有串联结构和/或并联结构。
3.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤B中所述阴离子单元的配基包含季氨基。
4.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤B中所述上样时的上样载量为100-300mg/ml，保留时间≥3min。
5.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤B中所述预平衡使用的预平衡缓冲液为20mM PB、1M氯化钠，pH6.5-7.5。
6.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤B中所述上样中，所述第二料液满足：20mM PB、pH6.5-7.5，电导10.0-30.0mS/cm。
7.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤B中所述平衡和/或后平衡所采用的缓冲液为：20mM PB,100～400mM
8.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤A中所述亲和填料选自：Mabselect sure LX、MabSelec PrismA、NMab Pro、NMab、UniMab 50HCProteinA、UniMab 50Protein A、ATProteinADiamond、AT Protein A Diamond Plus、ATProtein A Diamond Plus、Novo-A Diamond、Extrem ADiamond、Capto L、Protein G。
9.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤A中所述上样时的上样载量为≤50mg/ml，保留时间≥3min。
10.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤A中所述平衡和/或洗脱所采用的缓冲液含有5-50mM磷酸盐。
11.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤A中所述洗脱液为助剂浓度为20～200mM的缓冲液，所述助剂选自：甘氨酸-盐酸、醋酸钠-醋酸、柠檬酸钠-柠檬酸。
...【技术特征摘要】
1.一种双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，包括
2.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤b中所述层析组件中具有多个单元组件时，单元组件之间具有串联结构和/或并联结构。
3.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤b中所述阴离子单元的配基包含季氨基。
4.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤b中所述上样时的上样载量为100-300mg/ml，保留时间≥3min。
5.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤b中所述预平衡使用的预平衡缓冲液为20mm pb、1m氯化钠，ph6.5-7.5。
6.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤b中所述上样中，所述第二料液满足：20mm pb、ph6.5-7.5，电导10.0-30.0ms/cm。
7.如权利要求1所述的双特异性抗体蛋白层析纯化方法，其特征在于，步骤b中所述平衡和/或后平衡所采用的缓冲液为：20mm pb,100～400mm氯化钠，ph6.5...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋明凯，刘青青，曹琬婷，张正亮，朱一翔，潘正骅，
申请(专利权)人：康日百奥生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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