【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肿瘤类器官模型构建，尤其涉及一种肿瘤类器官与自体外周血单个核细胞共培养模型及其构建方法与应用。
技术介绍
1、免疫治疗是通过调节机体免疫系统，利用其杀伤肿瘤细胞的一种癌症治疗方法。免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，icb）是免疫治疗中最常见也是最重要的一种策略。该方案为多种癌症治疗带来了重大突破，能够显著延长患者的总生存期。然而，癌细胞进化过程中会驯化肿瘤微环境、进行免疫和代谢重编程、产生多样性克隆从而逃避人体强大的免疫调控网络，给免疫治疗带来巨大的挑战。
2、类器官模型（organoid）是指在体外对多功能干细胞或人体的器官组织分离得到的成体干细胞进行培养，通过细胞自组装最终形成与来源组织或器官在细胞组成及空间结构上均保持较高一致性的细胞团。类器官在病理组织、基因组、转录组及蛋白组水平上均能够一定程度还原来源组织或器官的典型特征，同时能够保留原有器官的部分功能。因此，类器官模型非常适合研究人员在不同层面上对目标器官进行全方位的研究。
3、肿瘤患者来源的类器官（patient derived organoid，pdo），既可以保留原始肿瘤的异质性，还允许不同来源的肿瘤样本（如来源于穿刺活检、胸腔积液、循环肿瘤细胞）进行扩增，可以实现对肿瘤不同分期的建模。基于以上优势，pdo可以有效地应用于以下领域：1.肿瘤模型构建，pdo模型可以在体外模拟人体器官环境，构建肿瘤模型；2.肿瘤机制研究，可以通过pdo模型高度模拟肿瘤组织特征，保留与肿瘤组织的基因一致性，研究
4、近年来，使用pdo进行癌症个体化药物筛选的相关临床研究正在进行中，pdo是预测靶向治疗疗效以及用于新肿瘤靶点药物开发和大规模药物筛选的重要临床前模型，为癌症病人的治疗提供了巨大的助力。然而，常规的pdo模型缺乏自体免疫成分，直接将其用于免疫治疗疗效评估无法提供真实、有效的数据。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种肿瘤类器官与自体外周血单个核细胞共培养模型的构建方法，本专利技术将肿瘤类器官与病人来源的自体外周血单个核细胞（pbmc）共培养，能够有效地构建高度肿瘤细胞异质性以及免疫微环境异质性的3d模型，能够用于针对癌症病人抗肿瘤免疫药物的筛选，以及能够用于免疫治疗疗效评估且能够提供真实、有效的数据，为免疫治疗做出助力。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种肿瘤类器官与自体外周血单个核细胞共培养模型的构建方法，包括如下步骤：将肿瘤类器官与ifn-γ混合孵育，得ifn-γ处理过的肿瘤类器官；将ifn-γ处理过的肿瘤类器官消化成单个类器官，用培养液重悬，得单个类器官细胞悬液1；将单个类器官细胞悬液1与第二次共刺激混合液混合，得共培养混合细胞悬液；将共培养混合细胞悬液置于经anti-cd3包被的容器中，得肿瘤类器官与自体外周血单个核细胞共培养模型；
4、所述培养液由t细胞培养基和10%体积分数基质胶组成；所述t细胞培养基由rpmi-1640培养基、10%体积分数人ab血清、1%体积分数青霉素和链霉素、100-500iu/ml il-2和1-50μg/ml anti-cd28组成；
5、所述第二次共刺激混合液的制备方法为：将所述单个类器官细胞用t细胞培养基重悬，得单个类器官细胞悬液2；将自体外周血单个核细胞用t细胞培养基培养，得培养后外周血单个核细胞悬液；将培养后外周血单个核细胞悬液和单个类器官细胞悬液2混合，得第一次混合细胞悬液；将第一次混合细胞悬液置于经anti-cd3包被的容器中培养，得第一次共刺激混合液；将第一次共刺激混合液和单个类器官细胞悬液2混合，得第二次混合细胞悬液；将第二次混合细胞悬液置于经anti-cd3包被的容器中培养，得第二次共刺激混合液。
6、优选的，所述共培养混合细胞悬液中单个类器官细胞悬液1与第二次共刺激混合液中的细胞数量比为1:5。
7、优选的，所述共培养混合细胞悬液中基质胶的终体积分数为5%。
8、优选的，将肿瘤类器官与ifn-γ混合孵育时，ifn-γ的终浓度为150-250ng/ml。
9、优选的，所述单个类器官细胞悬液2的浓度为5×104个细胞/ml。
10、优选的，所述第一次混合细胞悬液中培养后外周血单个核细胞悬液和单个类器官细胞悬液2中的细胞数量比为（5-50）：1。
11、优选的，所述第二次混合细胞悬液中第一次共刺激混合液和单个类器官细胞悬液2中的细胞数量比为（5-50）：1。
12、优选的，所述肿瘤类器官包括肺癌类器官。
13、本专利技术还提供了一种肿瘤类器官与自体外周血单个核细胞共培养模型，所述共培养模型由上述构建方法构建所得。
14、本专利技术还提供了上述肿瘤类器官与自体外周血单个核细胞共培养模型在抗肿瘤药物筛选或在制备免疫治疗疗效评估产品中的应用。
15、本专利技术的有益效果：
16、本专利技术将肿瘤患者自体pbmc与肿瘤类器官进行共培养获得的模型，更接近患者体内肿瘤微环境。本专利技术采用两次共刺激的方式，能够刺激t细胞增殖，激活t细胞，复现肿瘤患者体内抗原刺激t细胞活化、增殖、分化的过程。本专利技术方法能够有效地构建高度肿瘤细胞异质性以及免疫微环境异质性的3d模型，能够用于针对癌症病人抗肿瘤免疫药物的筛选，以及能够用于免疫治疗疗效评估且能够提供真实、有效的数据，为免疫治疗做出助力。
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1.一种肿瘤类器官与自体外周血单个核细胞共培养模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将肿瘤类器官与IFN-γ混合孵育，得IFN-γ处理过的肿瘤类器官；将IFN-γ处理过的肿瘤类器官消化成单个类器官细胞，用培养液重悬，得单个类器官细胞悬液1；将单个类器官细胞悬液1与第二次共刺激混合液混合，得共培养混合细胞悬液；将共培养混合细胞悬液置于经anti-CD3包被的容器中，得肿瘤类器官与自体外周血单个核细胞共培养模型；
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述共培养混合细胞悬液中单个类器官细胞悬液1与第二次共刺激混合液中的细胞数量比为1:5。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述共培养混合细胞悬液中基质胶的终体积分数为5%。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将肿瘤类器官与IFN-γ混合孵育时，IFN-γ的终浓度为150-250ng/mL。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述单个类器官细胞悬液2的浓度为5×104个细胞/mL。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述第二次混合细胞悬液中第一次共刺激混合液和单个类器官细胞悬液2中的细胞数量比为（5-50）：1。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述肿瘤类器官包括肺癌类器官。
9.一种肿瘤类器官与自体外周血单个核细胞共培养模型，其特征在于，所述共培养模型由权利要求1-8任意一项所述构建方法构建所得。
10.权利要求9所述肿瘤类器官与自体外周血单个核细胞共培养模型在抗肿瘤药物筛选或在制备免疫治疗疗效评估产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种肿瘤类器官与自体外周血单个核细胞共培养模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将肿瘤类器官与ifn-γ混合孵育，得ifn-γ处理过的肿瘤类器官；将ifn-γ处理过的肿瘤类器官消化成单个类器官细胞，用培养液重悬，得单个类器官细胞悬液1；将单个类器官细胞悬液1与第二次共刺激混合液混合，得共培养混合细胞悬液；将共培养混合细胞悬液置于经anti-cd3包被的容器中，得肿瘤类器官与自体外周血单个核细胞共培养模型；
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述共培养混合细胞悬液中单个类器官细胞悬液1与第二次共刺激混合液中的细胞数量比为1:5。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述共培养混合细胞悬液中基质胶的终体积分数为5%。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将肿瘤类器官与ifn-γ混合孵育时，ifn-γ的终浓度为150-250ng...
【专利技术属性】
技术研发人员：王玉莹，孙涛，祁婉舒，
申请(专利权)人：零壹人工智能科技研究院南京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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