【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及一种广谱抗病毒融合蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
1、病毒传播能力强、变异率高，对人类生命健康构成严重威胁。
2、病毒感染后，宿主细胞会产生大量的dsrna。目前普遍认为dsrna主要是rna病毒复制过程中rna聚合酶的产物，或者是dna病毒复制过程中双向转录的产物，也可能是病毒感染引起宿主细胞应激，导致产生大量内源性dsrna。因此，动物细胞进化出了一系列病毒相关dsrna的受体，能够特异性识别和感知细胞内病毒相关的dsrna信号，并启动相应的先天免疫反应。视黄酸诱导基因i(retinoic acid-inducible gene i)样受体(rlr)是近年来发现的一类依赖病毒dsrna的受体，能够启动机体的抗病毒免疫反应。rlr主要由rig-i和mda5受体组成。它具有高度的家族同源性，并具有两个功能独立的结构域，分别是n端card信号结构域(caspase recruiter domain)和c端rna结合结构域(rbd)。其中，rna结合结构域决定了rlr识别细胞内病毒异常rna的特异性，card信号结构域决定了rlr受体的下游信号通路。然而，随着高致病性病毒的不断出现，说明病毒在进化过程中已经能够逃脱人类rlr介导的自然免疫反应，造成病毒感染并大规模传播。因此，制备新的融合蛋白重塑rlr，提高rlr识别病毒的能力，触发机体抗病毒免疫反应，防止病毒免疫逃避，是病毒药物研发中需要解决的关键问题。
技术实现思路
1、(一)解决的技
2、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种广谱抗病毒融合蛋白及其制备方法和应用。
3、(二)技术方案
4、为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
5、第一方面，本专利技术提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白由冠状病毒hku4-2的ns3b蛋白的dsrna结合域(dsrbd)和人apaf-1蛋白的card信号结构域组成的融合蛋白ns3b-apaf1。
6、第二方面，本专利技术还提供了编码融合蛋白ns3b-apaf1的基因，所述融合蛋白ns3b-apaf1的结构为：6*his-【bamhi】-ptd4–【xhoi】–rbd–【kpni】–card-【hindiii】；所述融合蛋白ns3b-apaf1的氨基酸序列如-seq id no.1所示，具体为：
7、hhhhhhgsyaraaarqarasgleyvsllnqfwqkqiksyketpsqyhylypprffykpvlgnlqhptkwcctikfyeysaqatectkasakqdaarliceqlgtmdakarncllqhrealekdiktsyimdhmisdgfltiseeekvrneptqqqraamlikmilkkdndsyvsfynallhegykdlaallhdgipvv
8、具体地，所述融合蛋白ns3b-apaf1的基因的构建方法，其特征在于，将如seq idno.4所示的ptd4序列、如seq id no.6所示的冠状病毒hku4-2的ns3b的rbd序列和如seq idno.7所示的apaf-1的card序列双酶切后连接入载体中整合。
9、本专利技术还含有融合蛋白ns3b-apaf1的基因的表达载体。
10、本专利技术还含有表达融合蛋白ns3b-apaf1的基因的载体的重组菌。
11、第三方面，本专利技术提供了一种融合蛋白的制备方法，所述融合蛋白按照以下步骤制备：
12、(1)将上述融合蛋白ns3b-apaf1基因序列通过双酶切连接至prset-b载体中，得到prset-ns3b-apaf1重组质粒；
13、(2)将步骤(1)得到的重组质粒转化至rosetta gami(de3)大肠埃希菌中，涂布含氨苄青霉素的lb平板培养过夜，挑取lb平板上单菌落放大培养，进行测序鉴定，测序序列吻合表示ns3b-apaf1融合蛋白表达载体构建成功，得到表达ns3b-apaf1融合蛋白的重组菌；
14、(3)将步骤(2)中重组菌进行放大培养，并经iptg诱导表达，收集菌体进行破碎，离心后收集沉淀，沉淀经洗涤、变性、复性即可得到ns3b-apaf1融合蛋白；
15、进一步地，步骤(1)具体包括以下步骤：
16、a、获得prset-ptd4载体：
17、合成两个寡核苷酸，序列如下：
18、catggatcctacgcccgtgccgccgcccgtcaggcccgtgccagtggt
19、(seq id no.2)和cgtactcgagaccactggcacgggcctg(seq id no.3)
20、进行退火、延伸，用bamhi和xhoi限制性内切酶进行酶切，得到细胞穿膜肽结构域(ptd4)cdna，其所编码的氨基酸序列为：yaraaarqara(seq id no.4)。将ptd4序列插入prset-b载体的bamhi和xhoi之间，得到prset-ptd4载体；
21、b、获得prset-ptd4-rbd载体：
22、ns3b-apaf1融合蛋白的rbd为bat coronavirus hku4-2的a3exa5(uncharacterized protein ns3b)的rbd。由公司全合成ns3b的rbd片段，序列为序列前引入xhoi酶切位点，序列后引入kpni酶切位点，合成序列为：
23、ctcgagtacgtctctttgcttaaccaattttggcagaagcaaattaagtcttataaagagactcctagtcagtatcattacctgtatccacccaggtttttctataaacctgttttgggtaatttacagcaccctaccaagtggtgttgtactattaaattttatgagtatagtgctcaggctactgagtgtactaaagcatcagcaaaacaagatgcagctagacttatctgtgaacagttaggtacc(seq id no.5)其蛋白序列为：
24、yvsllnqf wqkqiksyke tpsqyhylyp prffykpvlg nlqhptkwcc tikfyeysaqatectkasak qdaarliceq l(seq id no.6)
25、用xhoi和kpni限制性内切酶进行酶切，得到ns3b的rbd，将其插入prset-ptd4载体的xhoi和kpni之间；得到prset-ptd4-rbd载体；
26、c、获得prset-ns3b-apaf1重组质粒：
27、ns3b-apaf1融合蛋白的card为人apaf-1的card，上游引物前引入kpni酶切位点，下游引物引入hindiii酶切位点。提取人细胞rna，反转录为cdna，用引物扩增人apaf-1的card，其序列为：
<本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由冠状病毒HKU4-2的NS3b蛋白的dsRNA结合域(dsRBD)和人Apaf-1蛋白的CARD信号结构域组成的融合蛋白NS3b-Apaf1。
2.编码如权利要求1所述的一种融合蛋白的基因，其特征在于，所述融合蛋白NS3b-Apaf1的结构为：6*His-【BamHI】-PTD4–【XhoI】–RBD–【KpnI】–CARD-【HindIII】；所述融合蛋白NS3b-Apaf1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求2所述的融合蛋白NS3b-Apaf1的基因的构建方法，其特征在于，将如SEQID NO.4所示的PTD4序列、如SEQ ID NO.6所示冠状病毒HKU4-2的NS3b的RBD序列和如SEQID NO.7所示的人Apaf-1的CARD序列通过双酶切连接入载体中整合。
4.含有如权利要求2所述的基因的表达载体。
5.含有如权利要求4所述的表达载体的重组菌。
6.如权利要求1所述的一种融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白按照以下步骤制备：>
7.如权利要求1所述的一种融合蛋白NS3b-Apaf1用于制备针对高致病性病毒的抗病毒药物和/或疫苗的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由冠状病毒hku4-2的ns3b蛋白的dsrna结合域(dsrbd)和人apaf-1蛋白的card信号结构域组成的融合蛋白ns3b-apaf1。
2.编码如权利要求1所述的一种融合蛋白的基因，其特征在于，所述融合蛋白ns3b-apaf1的结构为：6*his-【bamhi】-ptd4–【xhoi】–rbd–【kpni】–card-【hindiii】；所述融合蛋白ns3b-apaf1的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求2所述的融合蛋白ns3b-apaf1的基因的构建方...
【专利技术属性】
技术研发人员：王媛媛，杨静华，薛新丽，张蕾，陈金凤，高育源，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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