【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及epe-p3-max引导编辑系统、核酸分子、重组载体、重组转化子及应用，涉及基因编辑。
技术介绍
1、随着生命体基因组序列的揭示及生物信息学的发展，对基因组进行精确改造一直是生命科学领域重要的研究课题。引导编辑(prime editing,pe)系统是基于crispr/cas9系统新研发出的一项靶基因修饰技术，在无需供体dna存在下可以实现任意碱基的互换、短片段的插入和敲除，是基因修饰强有力的工具。2019年，david liu实验室开发的第一代pe系统由莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(moloney murine leukemia virus reversetranscriptase,m-mlv rt)、化脓性链球杆菌的cas9切刻酶(h840a突变)(streptococcuscas9 nickase，spcas9n)和引导编辑向导rna(prime editing guide rna,pegrna)组成，pegrna包括引导spcas9n结合靶位点的sgrna、引物结合位点(primer binding site,pbs)和逆转录模板(reverse transcription template,rtt)。
2、由于pe系统强大的编辑功能及普适性，其一经报道，便迅速在各种物种及各个研究领域进行应用。但目前pe系统应用的主要限制是其编辑效率低，本领域的研发重点聚焦于如何对pe系统进行优化，以提高pe系统的编辑效率。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种ep
2、本专利技术还提供编码上述epe-p3-max引导编辑系统的核酸分子、包括该核酸分子的重组载体、重组转化子及应用。
3、本专利技术第一方面提供一种epe-p3-max引导编辑系统，包括pegrna和融合蛋白；
4、所述pegrna的5’端到3’端依次包括trna(gly)、切割编辑链的靶点序列、esgrna骨架、逆转录模板序列、引物结合位点序列、连接序列、tevopreq1基序和hdv核酶；
5、所述trna(gly)选自a1)、a2)、a3)中的一种：a1)如seq id no:2所示的核苷酸序列中t替换为u后的rna；a2)将seq id no:2所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的rna；a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的rna；
6、所述esgrna骨架选自b1)、b2)、b3)中的一种：b1)如seq id no:3所示的核苷酸序列中t替换为u后的rna；b2)将seq id no:3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的rna；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的rna；
7、所述tevopreq1基序选自c1)、c2)、c3)中的一种：c1)如seq id no:4所示的核苷酸序列中t替换为u后的rna；c2)将seq id no:4所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的rna；c3)与c1)或c2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的rna；
8、所述hdv核酶选自d1)、d2)、d3)中的一种：d1)如seq id no:5所示的核苷酸序列中t替换为u后的rna；d2)将seq id no:5所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的rna；d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的rna；
9、所述融合蛋白由nc蛋白、m-mlv rtδrnaseh、spcas9(r221k/n394k/h840a)和定位信号肽融合而成；
10、所述nc蛋白选自f1)、f2)、f3)中的一种：f1)氨基酸序列如seq id no:9所示；f2)与seq id no:9所示的氨基酸序列具有至少80％同一性且具有相同催化功能的蛋白；f3)seq id no:9所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同催化功能的蛋白；
11、所述m-mlv rtδrnase h选自g1)、g2)、g3)中的一种：g1)氨基酸序列如seq idno:10所示；g2)与seq id no:10所示的氨基酸序列具有至少80％同一性且具有相同催化功能的酶；g3)seq id no:10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同催化功能的酶；
12、所述spcas9(r221k/n394k/h840a)选自h1)、h2)、h3)中的一种：h1)氨基酸序列如seq id no:11所示；h2)与seq id no:11所示的氨基酸序列具有至少80％同一性且具有相同催化功能的酶；h3)seq id no:11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同催化功能的酶。
13、本专利技术对pe系统的优化改造包括pegrna部分的优化和融合蛋白部分的优化。pegrna部分的优化主要是提高pegrna稳定性和表达量，通过在pegrna的3’端添加rna结构基序tevopreql(trimmed evopreql)来增加pegrna的稳定性；通过pegrna骨架优化提高编辑效率，将原本的sgrna骨架的茎环中去除了一个假定的pol-iii终止子，并且扩展sgrna与cas9结合发夹结构，使sgrna骨架更稳定；利用trna和hdv核酶有助于促进pegrna的表达。融合蛋白部分的优化包括去除m-mlv rt的rnaseh结构域、spcas9n突变体引入氨基酸突变(r221k/n394k)、并插入病毒核衣壳蛋白(nc蛋白)，以提高pe系统的编辑效率。
14、在一种具体实施方式中，参考图1所示，所述pegrna的5’端到3’端依次包括trna(gly)、切割编辑链的靶点序列、esgrna骨架、逆转录模板序列(rtt)、引物结合位点序列(pbs)、连接序列、tevopreq1基序和hdv核酶。
15、为了进一步增强pegrna的转录，提高编辑效率，启动所述pegrna转录的启动子为u6复合启动子(u6composite)，u6复合启动子由camv 35s启动子(花椰菜花叶病毒的35s启动子，the cauliflower mosaic virus 35spromoter)、cmylcv启动子(黄叶卷曲病毒(cmylcv)启动子，the cestrum yellow leaf curling virus(cmylcv)promoter)和缩短的u6-26启动子组成；具体地，u6复合启动子的核苷酸序列如seq id no:1所示。
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【技术保护点】
1.一种ePE-P3-max引导编辑系统，其特征在于，包括pegRNA和融合蛋白；
2.根据权利要求1所述的ePE-P3-max引导编辑系统，其特征在于，所述引导编辑系统还包括nick esgRNA；
3.根据权利要求1所述的ePE-P3-max引导编辑系统，其特征在于，启动所述pegRNA转录的启动子为复合启动子，所述复合启动子包括CaMV 35S启动子、CmYLCV启动子和缩短的U6-26启动子；
4.根据权利要求1所述的ePE-P3-max引导编辑系统，其特征在于，所述定位信号肽为核定位信号肽NLS、bpNLS、包括NLS的连接序列中的一种；所述NLS的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述bpNLS的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，包括NLS的连接序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
5.根据权利要求1所述的ePE-P3-max引导编辑系统，其特征在于，所述融合蛋白是由NC蛋白、M-MLV RTΔRNaseH、SpCas9(R221K/N394K/H840A)、定位信号肽和蛋白标签融合而成的融合
6.一种编码权利要求1-5任一项所述的ePE-P3-max引导编辑系统的核酸分子。
7.一种包括权利要求6所述的核酸分子的重组载体。
8.一种重组转化子，其特征在于，包括权利要求7所述的重组载体。
9.权利要求1-5任一所述的ePE-P3-max引导编辑系统、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的重组载体、权利要求8所述的重组转化子在如下S1)-S5)任一种中的应用：
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物为X1)、X2)、X3)中的一种：
...【技术特征摘要】
1.一种epe-p3-max引导编辑系统，其特征在于，包括pegrna和融合蛋白；
2.根据权利要求1所述的epe-p3-max引导编辑系统，其特征在于，所述引导编辑系统还包括nick esgrna；
3.根据权利要求1所述的epe-p3-max引导编辑系统，其特征在于，启动所述pegrna转录的启动子为复合启动子，所述复合启动子包括camv 35s启动子、cmylcv启动子和缩短的u6-26启动子；
4.根据权利要求1所述的epe-p3-max引导编辑系统，其特征在于，所述定位信号肽为核定位信号肽nls、bpnls、包括nls的连接序列中的一种；所述nls的氨基酸序列如seq id no:12所示，所述bpnls的氨基酸序列如seq id no:13所示，包括nls的连接序列的氨基酸序列如seq id no:14所示。
5.根据权利要求1所述的epe-...
【专利技术属性】
技术研发人员：张辉，陈梦仪，徐雅琦，洪凡珺，汪冲，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：
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