【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其是涉及一种ddhd2基因突变的斑马鱼的构建方法及其应用。
技术介绍
1、目前，基因编辑技术飞速发展，广泛应用于动物模型的构建、基因功能研究中。crispr/cas9作为一种新型基因编辑技术，具有高位点特异性、设计灵活和易于操作的特点。
2、在生物学基因编辑技术的研究中通常采用兔及大、小鼠等啮齿动物，而构建这类动物模型存在时间较长、成本高、喂养空间需求大和遗传性状不稳定等问题。而斑马鱼作为模式生物优势突出。首先研究表明大约70％的人类基因在斑马鱼中具有功能同源物，其次斑马鱼饲养方便且成本低、胚胎透明、繁殖力强、发育迅速，受精后三天即可发育出较完善的神经系统，5dpf个体基本发育完全。另外通常在神经功能方面，斑马鱼具有与人类同源功能的几个关键脑区。在斑马鱼的神经递质谱中检测到许多重要的神经递质；其表现出较多与人类相似的复杂行为，包括社交、运动、情感和防御等，这对神经科学研究十分重要，在研究人类中枢神经系统药物上有很好的应用前景。
3、ddhd2基因位于人类染色体区域8p11.23，其编码的蛋白质属于哺乳动物胞内磷脂酶a1(ipla1)家族。该蛋白家族由三个平行序列组成——ddhd1，ddhd2和sec23ip。ddhd2包含wwe结构域、gxsxg脂肪酶模体、sam和ddhd结构域。研究结果提示ddhd2可能作为风险基因参与了精神分裂症的发生发展过程。然而，目前尚未有报道通过crispr/cas9技术构建ddhd2基因敲除的斑马鱼模型。
技术实现思路b>
1、本专利技术的目的在于提供一种ddhd2基因突变的斑马鱼模型的构建方法及其应用，以解决现有技术中存在的构建动物模型周期长，成本高的技术问题。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供的一种ddhd2基因突变的斑马鱼模型的构建方法，包括以下步骤：
3、步骤1，将rnp混合液导入斑马鱼受精卵中，将敲除效率达到50％以上的胚胎，在e3水中孵化，培养至成鱼，得到ddhd2基因功能缺失的f0代突变体斑马鱼；
4、步骤2，将所述f0代突变体斑马鱼与野生型斑马鱼外交，将敲除效率达到100％的胚胎培养至成鱼，对成鱼进行剪尾，得到可遗传的f1代突变体斑马鱼；
5、步骤3，将所述f1代突变体斑马鱼中的雌鱼与雄鱼内交，得到f2代胚胎，将达到设定敲除效率的胚胎培养至成鱼，对成鱼进行剪尾，得到ddhd2基因突变的f2代纯合突变体斑马鱼。根据检测结果，得到的f2代纯合突变体测序如图1(a)所示,与synthego网站预测的结果一致，如图1(b)所示。
6、进一步地，步骤1中所述rnp混合液含有sgrna、cas9蛋白；
7、所述rnp混合液的注射剂量为每个受精卵0.8-1.2nl；
8、每1ulrnp混合液中含有0.5-2umol的sgrna、0.1-1ug的cas9蛋白。
9、进一步地，所述sgrna的靶位点位于斑马鱼ddhd2基因的第五外显子，如图2所示。
10、进一步地，所述sgrna的靶位点的3’端为ngg。
11、优选地，sgrna的靶位点的5’端的gg二核苷酸为t7启动子的一部分；
12、优选地，所述sgrna对应的dna序列为：
13、cacctagtgttcatggttca。
14、进一步地，步骤1中所述斑马鱼受精卵应在受精后15min内导入所述rnp混合液。
15、进一步地，步骤3中所述设定敲除效率为100％。
16、进一步地，所述敲除效率的检测步骤如下：
17、步骤a，在斑马鱼胚胎受精72小时后(72hpf)，分别收集野生型和实验组胚胎，每200μl的pcr管中收集1颗胚胎，加入40μl50mm naoh,95℃裂解40分钟,随后加入4μl ph＝8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)进行中和。涡旋震荡30秒，瞬离后上清液即为斑马鱼基因组dna；
18、步骤b,取所述斑马鱼基因组dna，按照如下表1所示配方配制pcr反应体系试剂：
19、表1为pcr反应体系试剂配方：
20、
21、将上述pcr反应体系试剂振荡混匀之后离心，于pcr仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性95℃，3min，(变性95℃，15s，退火60℃，20s，延伸72℃，30s)进行32个循环，再72℃，10min。待反应结束后，离心得到含有目的dna片段的pcr产物；取5μl所述pcr产物于1％琼脂糖凝胶上进行电泳，检测pcr产物大小；
22、步骤c，将所述pcr产物进行sanger测序并经比对，得出sgrna的敲除效率。
23、优选地，所述引物的序列如下：
24、ddhd2-forward primer：gtcaatgctgaactgagtct；
25、ddhd2-reverse primer：tggagtctccactcggcctg。
26、本专利技术另一个目的在于提供一种筛选精神类药物的方法，所述方法是采用上述构建方法得到的ddhd2基因突变的斑马鱼模型来筛选效果突出的药物。
27、采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：
28、本专利技术提供的ddhd2基因突变的斑马鱼模型的构建方法，首次创造性地实现了斑马鱼磷脂酶a1合成关键基因ddhd2敲除；通过对本专利技术构建的斑马鱼模型的研究，可以明确ddhd2缺陷对斑马鱼脂质代谢的影响；利用本专利技术提供的斑马鱼模型进行药物效果研究具有检测通量高，检测周期短，检测灵敏度高，且检测载体的伦理限制少的优点，对于快速筛选及评价精神类药物及天然功效因子具有广泛的应用价值。
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1.一种ddhd2基因突变的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，步骤1中所述RNP混合液含有sgRNA、Cas9蛋白；
3.根据权利要求2所述的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的靶位点位于斑马鱼ddhd2基因的第五外显子。
4.根据权利要求2所述的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的靶位点的3’端为NGG。
5.根据权利要求2所述的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，所述sgRNA对应的DNA序列为CACCTAGTGTTCATGGTTCA。
6.根据权利要求1所述的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，步骤1中所述斑马鱼受精卵应在受精后15min内导入所述RNP混合液。
7.根据权利要求1所述的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，步骤3中所述设定敲除效率为100％。
8.根据权利要求1所述的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，所述设定敲除效率的检测步骤如下：
9.根据权利要求7所述的斑马鱼模型的
10.一种筛选精神类药物的方法，其特征在于，所述方法是采用权利要求1-9任一项所述的构建方法得到的ddhd2基因突变的斑马鱼模型来筛选效果突出的药物。
...【技术特征摘要】
1.一种ddhd2基因突变的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，步骤1中所述rnp混合液含有sgrna、cas9蛋白；
3.根据权利要求2所述的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，所述sgrna的靶位点位于斑马鱼ddhd2基因的第五外显子。
4.根据权利要求2所述的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，所述sgrna的靶位点的3’端为ngg。
5.根据权利要求2所述的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，所述sgrna对应的dna序列为cacctagtgttcatggttca。
【专利技术属性】
技术研发人员：李志强，彭利霞，吴传鸿，王宝堃，常开慧，
申请(专利权)人：青岛大学附属医院，
类型：发明
国别省市：
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