【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞应用领域，具体涉及一种通过动物源肌肉干细胞制备宠物食品的方法及所得产品。
技术介绍
1、鼠肉是猫类等宠物天性喜好的一种食物肉类，由于鼠肉富含大量的蛋白质、均衡的氨基酸、脂类和维生素等营养物质，能让猫更加健康活泼、毛色鲜亮。最重要的是鼠肉富含猫类必须的牛磺酸等成分，能加强猫的夜视能力。而猫类长期缺乏牛磺酸会患夜盲症。且牛磺酸缺乏还会导致猫的繁殖能力降低，主要表现为妊娠失败、流产和死胎。另外，会引起处于生长阶段的小猫后腿发育异常，如过度外展、麻痹，肌肉体积和张力下降等，导致其步态异常；另外，小猫的小脑重量也会降低。以上临床症状均为小脑功能障碍及小脑不成熟的表现，其原因是牛磺酸缺乏导致小脑成熟过程中细胞变化的延迟此外，牛磺酸对猫中枢神经系统的发育及维持正常功能具有重要作用。牛磺酸是脊椎动物中枢神经系统中较丰富的氨基酸，参与维持细胞膜结构完整，调节钙结合和转运，还是渗透调节器和抑制性神经传导物。
2、在不便使用老鼠作为猫类食物的情况下，虽然可以在猫的食品中添加牛磺酸等成分，但宠物食品的肉质来源一直难以保障并容易产生各种问题。尤其是活体鼠类容易携带多种危险的细菌和病毒，不适合作为宠物食品的来源。近几年来得到全球舆论和市场的广泛关注。宠物食品市场的各种商品的质量良莠不齐，其中肉类都来自养殖或野生动物，其生产、销售和使用过程中具有传播病原体的风险。由于当前的大型畜牧业的生产方法与公共卫生问题的复杂性，以及肉类生产相关的温室效应、环境退化以及动物福利和保护等问题，全球的不断增长的肉类需求引起了越来越多的担忧和负面
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的技术空白，本专利技术提供了一种通过动物源的肌肉干细胞制备宠物食品的方法。
2、本专利技术的另一目的为提供了一种利用上述方法制备得到的宠物食品。
3、本专利技术为了实现上述目的所采用的技术方案为：
4、本专利技术提供了一种通过动物源肌肉干细胞制备宠物食品的方法，包括以下步骤：
5、（1）高活性肌肉和脂肪前体细胞的一体化分离培养的技术： 将肌肉和脂肪组织，切碎混合后酶解获得原代细胞，然后通过差速贴壁法培养快速获得两组细胞，得具有成脂分化能力的细胞，作为脂肪前体细胞；使用流式细胞仪分别根据aldh1和vcam1的表达水平筛选出aldh1/vcam1高表达的具有成肌分化能力的细胞，作为肌肉前体细胞；
6、（2）结合细胞支架的大规模立体培养分化技术：将处于对数生长期（对数生长期是指原代细胞开始培养后一段时间进入快速生长阶段，本专利技术为第4到6代）的肌肉前体细胞和脂肪前体细胞以一定的比例种入植物叶片的去细胞化的细胞外基质制备的细胞生长支架，加入培养基，进行扩增培养，然后进行分化培养得宠物食品。
7、进一步的，步骤（1）中，所述酶解的具体过程为：将切碎混合的肌肉和脂肪组织中加入消化酶和胰酶进行酶解；所述消化酶为i型胶原蛋白酶和中性蛋白酶ii的混合酶， i型胶原蛋白酶的终浓度为0.1%~0.5%（w/v），中性蛋白酶ii的终浓度为0.2~0.5%（w/v），消化时间为1-2小时；所述胰酶的终浓度为1%~5%（w/v）， 消化时间为0.5-1小时。
8、进一步的，步骤（1）中，两组细胞具体为：（1）2~4小时内贴壁的脂肪间充质干细胞和肌肉间充质干细胞的混合细胞群；（2）48~60小时以后贴壁的肌肉前体细胞。
9、进一步的，步骤（1）中，筛选分离的aldh1/vcam1高表达的肌肉前体细胞占总量的10~40%。
10、进一步的，步骤（2）中，所述肌肉前体细胞和脂肪前体细胞的比例为 4：1～10：1。
11、进一步的，步骤（2）中，所述细胞生长支架的制备方法为：将植物叶片使用0.5~2.5%sds和2~4% triton-x100 依次振摇处理2~6小时，从而得到脱细胞的细胞外基质薄层，水洗、灭菌后即得。
12、进一步的，步骤（2）中，所述培养基为含有jagged1多肽（20mg/l）、nmn(300mg/l)和10mg/l fbs 的dmem；扩增培养的时间为10-15天。
13、进一步的，步骤（2）中，所述分化具体为：扩增培养后，将培养基更换为成肌分化培养液，进行成肌分化7-10d；然后再次更换为成脂分化培养液，进行成脂分化3-6d。
14、进一步的，所述成肌分化培养液的组成为：95%（v/v）dmem培养基、 3 %（v/v）胎牛血清、2%(v/v)100x谷氨酰胺、35mg/ml葡萄糖、300mg/l nmn；所述成脂分化培养液的组成为：83%（v/v）dmem培养基、 15%（v/v）胎牛血清、2%(v/v)100x谷氨酰胺、35mg/ml葡萄糖、300mg/l nmn、10μm y-27632、1.5μg/ml胰岛素和1.5mg/ml磷脂酰胆碱。
15、本专利技术还提供了一种利用上述方法制备得到的宠物食品。
16、本专利技术所使用的肌肉和脂肪组织提取来自健康年轻鼠类；但来源并不仅限于鼠类。本专利技术还可扩展到人造兔肉或牛肉作为狗粮等方向，实现环保安全无动物伦理问题的多种宠物食品原料的新选择。
17、本专利技术所使用的细胞生长支架，可以采用任意的植物叶片；本专利技术采用的为薄荷叶片。
18、本专利技术的有益效果为：
19、（1）本专利技术提供的细胞培养肉技术在一定程度上可以缓解畜牧业相关的危害。而基于肌肉干细胞的细胞培养肉（cell-based meat/cbm）技术可以实现鼠肉及其他动物肉的直接生产，不再需要具有传染病等病原体危害风险的野生或养殖的动物。人造肉不仅营养丰富，也不需要额外添加各类成分，再结合一定比率的脂肪组织可以提升营养和口味；同时，该方法也可明显提升成肌和成脂前体细胞的分离的效率，降低成本。
20、（2）本专利技术提供的方法建立在成功地进行了从小鼠提取高活性地肌肉和脂肪前体细胞并进行了体外成肌肉纤维和成脂肪分化的基础上，通过高活性肌肉和脂肪前体细胞的获取方法，高效的3d细胞生长和分化体系，和高效的细胞培养液的配成方法。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种通过动物源肌肉干细胞制备宠物食品的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述酶解的具体过程为：将切碎混合的肌肉和脂肪组织中加入消化酶和胰酶进行酶解；所述消化酶为I型胶原蛋白酶和中性蛋白酶II的混合酶， I型胶原蛋白酶的终浓度为0.1%~0.5%（w/v），中性蛋白酶II的终浓度为0.2~0.5%（w/v），消化时间为1-2小时；所述胰酶的终浓度为1%~5%（w/v）， 消化时间为0.5-1小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，两组细胞具体为：（1）2~4小时内贴壁的脂肪间充质干细胞和肌肉间充质干细胞的混合细胞群；（2）48~60小时以后贴壁的肌肉前体细胞。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，筛选分离的ALDH1/VCAM1高表达的肌肉前体细胞占总量的10~40%。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述肌肉前体细胞和脂肪前体细胞的比例为 4：1～10：1。
6.根据权利要求1
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述培养基为含有Jagged1多肽（20mg/L）、NMN(300mg/L) 和10mg/L FBS 的DMEM；扩增培养的时间为10-15天。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述分化具体为：扩增培养后，将培养基更换为成肌分化培养液，进行成肌分化7-10d；然后再次更换为成脂分化培养液，进行成脂分化3-6d。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述成肌分化培养液的组成为：95%（v/v）DMEM培养基、 3 %（v/v）胎牛血清、2%(v/v)100X谷氨酰胺、35mg/mL葡萄糖、300mg/L NMN；所述成脂分化培养液的组成为：83%（v/v）DMEM培养基、 15%（v/v）胎牛血清、2%(v/v)100X谷氨酰胺、35mg/mL葡萄糖、300mg/L NMN、10μM Y-27632、1.5μg/mL胰岛素和1.5mg/mL磷脂酰胆碱。
10.一种利用权利要求1-9任一项所述的方法制备得到的宠物食品。
...【技术特征摘要】
1.一种通过动物源肌肉干细胞制备宠物食品的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述酶解的具体过程为：将切碎混合的肌肉和脂肪组织中加入消化酶和胰酶进行酶解；所述消化酶为i型胶原蛋白酶和中性蛋白酶ii的混合酶， i型胶原蛋白酶的终浓度为0.1%~0.5%（w/v），中性蛋白酶ii的终浓度为0.2~0.5%（w/v），消化时间为1-2小时；所述胰酶的终浓度为1%~5%（w/v）， 消化时间为0.5-1小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，两组细胞具体为：（1）2~4小时内贴壁的脂肪间充质干细胞和肌肉间充质干细胞的混合细胞群；（2）48~60小时以后贴壁的肌肉前体细胞。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，筛选分离的aldh1/vcam1高表达的肌肉前体细胞占总量的10~40%。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述肌肉前体细胞和脂肪前体细胞的比例为 4：1～10：1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述细胞生长支架的制备方法为：将植物叶片使用0.5~2.5%sd...
【专利技术属性】
技术研发人员：牟晓东，任世凤，张亚君，岳贤林，崔捷，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。