【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体地讲，涉及一种生产高乳酸组分的p(3hb-co-la)的大肠杆菌基因工程菌及其应用。
技术介绍
1、目前，常用的塑料大多是由石油和天然气等化石燃料合成的，导致了全球变暖及固体废弃物积累等环境问题，这些问题催促我们开发利用可持续的原料生产生物基聚合物。聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxy alkanoates,pha)是由微生物产生的一种聚酯，目前因其生物可降解性、光学性能和生物相容性等优良性质引起了研究者的广泛关注。
2、聚乳酸是一种很有前景的生物质衍生聚合物，因为它可以替代石油基塑料，具有几种理想的性质，如生物降解性、生物相容性和可堆肥性。聚乳酸本身无毒，但是传统生化方法生产中的金属催化剂残留会影响其在医学等方面的应用。可惜目前由于缺乏天然的乳酸聚合酶，无法实现在生物体内一步生产。seiichi taguchi等利用底物相似性原则，通过对pha合成酶进行突变成功地创造了微生物生物合成乳酸基聚酯的体系——聚3羟基丁酸乳酸酯p(3hb-co-la)。
3、聚3羟基丁酸乳酸酯[p(3hb-co-la)]是pha家族的一种，该聚合物融合了聚乳酸以及聚3-羟基丁酸两种材料的特性，而且其弹性和透明度可以通过改变p(3hb-co-la)中的乳酸组分来调节，因此调控共聚物中的乳酸组分是该研究的关键。
4、p(3hb-co-la)由经过突变的、具有乳酸聚合活性的pha合成酶聚合3-羟基丁酰辅酶a(3hb-coa)和乳酰辅酶a(la-coa)合成。为了进一步提高乳酸组分含量，研究者
5、之前的研究都集中于单一的提高聚合物中的乳酸组分，但是所得聚合物中的乳酸组分都是固定的，不能灵活调控乳酸组分，这种的单一生产策略很难满足市场对具有不同材料学性质聚合物的需求。
6、cn110295188a公开了一种提高大肠杆菌合成的聚(3-羟基丁酸-co-乳酸)中乳酸组分含量的方法，以e.coli mg1655为宿主，以启动子trc控制phaa、phab、phacm基因的重组表达，以阿拉伯糖启动子控制pctth基因的重组表达构建获得重组大肠杆菌e.coli mg-01，在此基础上敲除黄素异戊烯基转移酶基因ubix，和/或敲除d-乳酸脱氢酶基因dld，和/或替换表达丙酰辅酶a转移酶pctcp的启动子为组成型的ldha启动子，并没有从动态调控乳酸组分的角度进行改造，因此无法将乳酸组分直接提高到一个很高的比例。
7、cn116640708a公开了一种可调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的基因工程菌及其构建方法及应用，该基因工程菌的构建是将用m2启动子控制的基因pctcp整合至大肠杆菌的基因组上，构建了重组菌株wj01，然后以重组菌株wj01为出发菌株，通过钙转化转入ptrc991abc质粒与pbad-ptrc-lepgt质粒获得生产菌株。其公开的方法基于可控弱化细胞电子传递链活性的策略实现了对聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分的灵活调控。但是当使用该方法合成高乳酸组分共聚物时，对菌株电子传递链的过度弱化导致了菌株生长及产量的降低。
8、据报道，来自菌株p.stutzeri wm88的亚磷酸盐脱氢酶ptxd可以在将亚磷酸盐催化为磷酸盐的同时将nad+还原为nadh。多项研究都表明ptxd是一种可以提供大量nadh以增强细胞中nadh依赖性反应的理想酶。在热力学的驱动下，亚磷酸盐的氧化是几乎不可逆的反应，并且反应产生的磷酸盐不会显着抑制菌株生长或ptxd的活性。此外，包括大肠杆菌在内的大多数细菌都不能利用亚磷酸盐，亚磷酸盐的额外添加不会影响菌株正常的代谢反应。
技术实现思路
1、本专利技术的目的就在于解决现有技术中所存在的聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量以及菌株生长及产量之间的矛盾，以期在提高聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的同时，维持菌株的生长及产量。
2、为实现上述目的，本专利技术的第一个方面，提供了一种大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌是通过将聚羟基脂肪酸酯表达通路的丙酸辅酶a转移酶基因pctth以及亚磷酸盐脱氢酶基因ptxd整合至大肠杆菌的基因组中进行表达，同时将聚羟基脂肪酸酯表达通路的β-酮硫解酶基因phaa、乙酰乙酰辅酶a还原酶基因phab、以及pha合成酶基因phacm通过质粒转化至大肠杆菌中进行表达而得到。
3、根据本专利技术的优选实施例，所述亚磷酸盐脱氢酶基因ptxd的序列如seq id no.17所示。
4、根据本专利技术，所述将聚羟基脂肪酸酯表达通路的丙酸辅酶a转移酶基因pctth至大肠杆菌的基因组中进行表达是在基因组中整合了用m2启动子控制的丙酸辅酶a转移酶基因pctth。
5、根据本专利技术，所述将聚羟基脂肪酸酯表达通路的亚磷酸盐脱氢酶基因ptxd整合至大肠杆菌的基因组中进行表达是在基因组中整合了用m2启动子控制的亚磷酸盐脱氢酶基因ptxd。
6、根据本专利技术，所述将聚羟基脂肪酸酯表达通路的β-酮硫解酶基因phaa、乙酰乙酰辅酶a还原酶基因phab、以及pha合成酶基因phacm通过质粒转化至大肠杆菌中进行表达，是在大肠杆菌中转入质粒ptrc99aabc。
7、本专利技术的第二个方面，提供过了所述的大肠杆菌基因工程菌用于生产高乳酸组分的p(3hb-co-la)的应用。
8、本专利技术的第三个方面，提供了一种生产高乳酸组分的p(3hb-co-la)的方法，所述方法是使用所述的大肠杆菌基因工程菌发酵来进行。
9、根据本专利技术的优选实施例，所述发酵是以m9培养基为发酵培养基，采用葡萄糖或木糖作为碳源，添加诱导剂iptg进行发酵。
10、本专利技术的第四个方面，提供了一种可调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的基因工程菌，所述基因工程菌是在大肠杆菌的基因组中整合了用m2启动子控制的基因pctth，并转入了质粒ptrc99aabc与pbad-ptrc-ptxd。
11、本专利技术的第五个方面，提供了一种调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的方法，采用所述的基因工程菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯，并通过调节诱导剂iptg的浓度来调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分的含量。
12、本专利技术具有以下有益效果：
13、1、基因组表达系统相比于质粒表达系统具有更强的稳定性，并且不会占用过多的细胞资源而造成代谢负担。本专利技术的基于ptxd的nadh再生策略经过基因组整合后表现出更为优异的调控效果并且对工程菌株天然代谢网络的扰动更加柔性，不会对菌株生长或产物合成造成明显的负面影响。
1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过将聚羟基脂肪酸酯表达通路的丙酸辅酶A转移酶基因pctth以及亚磷酸盐脱氢酶基因ptxD整合至大肠杆菌的基因组中进行表达，同时将聚羟基脂肪酸酯表达通路的β-酮硫解酶基因phaA、乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phaB、以及PHA合成酶基因phaCm通过质粒转化至大肠杆菌中进行表达而得到。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述亚磷酸盐脱氢酶基因ptxD的序列如SEQ ID NO.17所示。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述将聚羟基脂肪酸酯表达通路的丙酸辅酶A转移酶基因pctth至大肠杆菌的基因组中进行表达是在基因组中整合了用m2启动子控制的丙酸辅酶A转移酶基因pctth。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述将聚羟基脂肪酸酯表达通路的亚磷酸盐脱氢酶基因ptxD整合至大肠杆菌的基因组中进行表达是在基因组中整合了用m2启动子控制的亚磷酸盐脱氢酶基因ptxD。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于
6.权利要求1～5中任一项所述的大肠杆菌基因工程菌的应用，其特征在于，用于生产高乳酸组分的P(3HB-co-LA)。
7.一种生产高乳酸组分的P(3HB-co-LA)的方法，其特征在于，所述方法是使用权利要求1～5中任一项所述的大肠杆菌基因工程菌发酵来进行。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵是以M9培养基为发酵培养基，采用葡萄糖或木糖作为碳源，添加诱导剂IPTG进行发酵。
9.一种可调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌的基因组中整合了用m2启动子控制的基因pctth，并转入了质粒pTrc99aABC与pBAD-Ptrc-ptxD。
10.一种调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求9所述的基因工程菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯，并通过调节诱导剂IPTG的浓度来调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分的含量。
...【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过将聚羟基脂肪酸酯表达通路的丙酸辅酶a转移酶基因pctth以及亚磷酸盐脱氢酶基因ptxd整合至大肠杆菌的基因组中进行表达，同时将聚羟基脂肪酸酯表达通路的β-酮硫解酶基因phaa、乙酰乙酰辅酶a还原酶基因phab、以及pha合成酶基因phacm通过质粒转化至大肠杆菌中进行表达而得到。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述亚磷酸盐脱氢酶基因ptxd的序列如seq id no.17所示。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述将聚羟基脂肪酸酯表达通路的丙酸辅酶a转移酶基因pctth至大肠杆菌的基因组中进行表达是在基因组中整合了用m2启动子控制的丙酸辅酶a转移酶基因pctth。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述将聚羟基脂肪酸酯表达通路的亚磷酸盐脱氢酶基因ptxd整合至大肠杆菌的基因组中进行表达是在基因组中整合了用m2启动子控制的亚磷酸盐脱氢酶基因ptxd。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述将聚羟基脂肪酸酯表达通路的...
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