一种黑龙骨茎叶质量测定方法技术

技术编号：42695130 阅读：1 留言：0更新日期：2024-09-13 11:52

本发明专利技术公开了黑龙骨茎叶一种黑龙骨茎叶质量测定方法，所述方法包括指纹图谱建立及相似度分析、含量测定、结合聚类分析、主成分分析和偏最小二乘判别分析方法。本发明专利技术方法是对15批不同产地黑龙骨茎叶进行UPLC指纹图谱分析和相似度分析，发现共有28个共有峰，并用对照品指认其中7个共有峰，分别是峰4(新绿原酸)、峰8(绿原酸)、峰9(咖啡酸)、峰11(隐绿原酸)、峰22(异槲皮苷)、峰24(紫云英苷)、峰28(异绿原酸C)。本发明专利技术方法灵敏度高、专属性好，稳定可行，为黑龙骨茎叶质量评价及控制提供参考依据。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药材多种成分测定方法，特别是一种黑龙骨茎叶质量测定方法。

技术介绍

1、黑龙骨periploca forrestii schltr.为萝藦科杠柳属植物，俗称西南杠柳，其藤茎黑骨藤在《中华本草苗药卷》中收载为苗药。具有舒筋活血、祛风除湿、清热解毒等功效，长期以来被作为苗族民间传统草药用于治疗风湿等疾病，是贵州省当前重要发展的苗药之一。非药用部位黑龙骨茎叶关于化学成分及药理作用鲜有报道，并且其因为非临床用药部位而被大量丢弃，造成资源极大浪费及环境污染。因此本课题组前期对黑龙骨的藤茎部位进行了初步研究，结果发现此部位含有咖啡酰基奎宁酸类成分，而咖啡酰奎宁酸类成分具有较强的抑菌抗炎活性。

2、为了更好的开发利用黑龙骨茎叶资源，有效保证其资源质量，需要建立质量评价方法更好的控制其品质。因此，本研究采用多指标含量测定结合聚类分析、主成分分析、偏最小二乘判别分析对不同产地黑龙骨茎叶进行分析，明确不同产地差异性成分，以期为黑龙骨茎叶质量评价及质量控制提供参考依据，同时为其茎叶资源的有效利用开发提供参考。

技术实现思路

1、本专利技术的目的在于，提供一种黑龙骨茎叶质量测定方法，能建立黑龙骨茎叶指纹图谱，并检测黑龙骨茎叶中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异槲皮苷、紫云英苷、异绿原酸c的含量，该分析方法灵敏度高、专属性好，稳定可行，并通过结合聚类分析、主成分分析和偏最小二乘判别，区分不同产地的质量差异，为黑龙骨茎叶质量评价及控制提供参考依据。

2、本专利技术的技

3、(1)混合对照品溶液的制备：精密称取14.5-16.5mg新绿原酸、11.5-13.5mg绿原酸、11.5-13.5mg隐绿原酸置于10ml容量瓶中，加入75％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液①；另外精密称取2-4mg咖啡酸、4.5-6.5mg异槲皮苷、4-6mg紫云英苷、7.5-9.5mg异绿原酸c置于50ml容量瓶，加入75％乙醇至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液②；从混合对照品溶液①和合对照品溶液②中各吸取1ml置于同一10ml的容量瓶中，加入75％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液③；

4、(2)供试品溶液的制备：精密称取黑龙骨茎叶样品0.4-0.6g，置于20ml锥形瓶中，加入75％乙醇10ml，精密称重，超声提取20-40min，放冷，补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液；

5、(3)色谱条件：采用agilent eclipse plus c18色谱柱，色谱柱规格为2.1×100mm,1.8μm，体积流量0.2ml/min，乙腈为流动相b，0.1％磷酸水为流动相a，进行梯度洗脱，进样量0.8μl，柱温30℃，检测波长为1-49min，327nm；49-70min，254nm；70-85min，327nm；

6、(4)指纹图谱建立及相似度分析：将不同产地黑龙骨茎叶的供试品溶液分别在色谱条件下进行uplc测定，将样品色谱图转换为aia格式，数据导入2012版中药色谱指纹图谱相似度评价系统，将第一批次样品图谱作为参照图谱，时间窗宽设置为0.1，利用多点校正，经过marker峰匹配，生成黑龙骨茎叶指纹叠加图谱和对照图谱，并进行相似度计算，得到共有峰；再另取混合对照品溶液③在色谱条件下进样测定，得到对照品色谱图，通过对照品色谱峰及紫外吸收波长对比，指认特征峰，建立指纹图谱；

7、(5)含量测定：采用超高效液相色谱法，将供试品溶液和混合对照品溶液③分别在色谱条件下进行检测，有效分离黑龙骨茎叶中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、紫云英苷和异绿原酸c，记录峰面积，并计算供试品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、紫云英苷和异绿原酸c的含量；

8、(6)结合聚类分析、主成分分析和偏最小二乘判别分析对不同产地黑龙骨茎叶进行分析。

9、前述步骤(1)中，混合对照品溶液的制备：精密称取15-16mg新绿原酸、12-13mg绿原酸、12-13mg隐绿原酸置于10ml容量瓶中，加入75％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液①；另外精密称取2.5-3.6mg咖啡酸、5-6mg异槲皮苷、4.5-5.5mg紫云英苷、8-9mg异绿原酸c置于50ml容量瓶，加入75％乙醇至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液②；从混合对照品溶液①和合对照品溶液②中各吸取1ml置于同一10ml的容量瓶中，加入75％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液③。

10、具体的说，前述步骤(1)中，混合对照品溶液的制备：精密称取15.2mg新绿原酸、12.4mg绿原酸、12.6mg隐绿原酸置于10ml容量瓶中，加入75％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液①；另外精密称取3.1mg咖啡酸、5.6mg异槲皮苷、4.9mg紫云英苷、8.5mg异绿原酸c置于50ml容量瓶，加入75％乙醇至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液②；从混合对照品溶液①和合对照品溶液②中各吸取1ml置于同一10ml的容量瓶中，加入75％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液③。

11、前述步骤(2)中，供试品溶液的制备：精密称取黑龙骨茎叶样品0.45-0.55g，置于20ml锥形瓶中，加入75％乙醇10ml，精密称重，超声提取25-35min，超声功率200w，超声频率40khz，放冷，补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

12、具体的说，前述步骤(2)中，供试品溶液的制备：精密称取黑龙骨茎叶样品0.5g，置于20ml锥形瓶中，加入75％乙醇10ml，精密称重，超声提取30min，超声功率200w，超声频率40khz，放冷，补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

13、前述步骤(3)中，洗脱梯度为0-9min，7-7.5％b；9-28min，7.5-9％b；28-31min，9-13％b；31-55min，13-13％b；55-60min，13-14％b；60-62min，14-16％b；62-67min，16-18％b；67-72min，18-18％b；72-75min，18-21.5％b；75-80min，21.5-65％b；80-85min，65-95％b。

14、前述步骤(4)中，所述特征峰分别为：峰4为新绿原酸，峰8为绿原酸，峰9为咖啡酸，峰11为隐绿原酸，峰22为异槲皮苷，峰24为紫云英苷、峰28为异绿原酸c。

15、前述步骤(6)中，所述结合聚类分析是将不同产地黑龙骨茎叶的共有峰导入spss26.0软件中进行聚类分析，以组间连接方法，选择欧式平方距离为聚类公式。

16、前述步骤(6)中，所述主成分分析是将不同产地黑龙骨茎叶共有峰峰面积作为变量进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种黑龙骨茎叶质量测定方法，其特征在于：黑龙骨茎叶质量测定方法包括指纹图谱建立及相似度分析、含量测定、结合聚类分析、主成分分析和偏最小二乘判别分析方法，具体的步骤如下：

2.如权利要求1所述的黑龙骨茎叶指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤(1)中，混合对照品溶液的制备：精密称取15-16mg新绿原酸、12-13mg绿原酸、12-13mg隐绿原酸置于10ml容量瓶中，加入75％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液①；另外精密称取2.5-3.6mg咖啡酸、5-6mg异槲皮苷、4.5-5.5mg紫云英苷、8-9mg异绿原酸C置于50mL容量瓶，加入75％乙醇至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液②；从混合对照品溶液①和合对照品溶液②中各吸取1ml置于同一10ml的容量瓶中，加入75％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液③。

3.如权利要求2所述的黑龙骨茎叶指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤(1)中，混合对照品溶液的制备：精密称取15.2mg新绿原酸、12.4mg绿原酸、12.6mg隐绿原酸置于10ml容量瓶中，加入75％乙醇溶液定容

4.如权利要求1所述的黑龙骨茎叶指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤(2)中，供试品溶液的制备：精密称取黑龙骨茎叶样品0.45-0.55g，置于20ml锥形瓶中，加入75％乙醇10mL，精密称重，超声提取25-35min，超声功率200W，超声频率40KHZ，放冷，补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

5.如权利要求4所述的黑龙骨茎叶指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤(2)中，供试品溶液的制备：精密称取黑龙骨茎叶样品0.5g，置于20ml锥形瓶中，加入75％乙醇10mL，精密称重，超声提取30min，超声功率200W，超声频率40KHZ，放冷，补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

6.如权利要求1所述的黑龙骨茎叶指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤(3)中，洗脱梯度为0-9min，7-7.5％B；9-28min，7.5-9％B；28-31min，9-13％B；31-55min，13-13％B；55-60min，13-14％B；60-62min，14-16％B；62-67min，16-18％B；67-72min，18-18％B；72-75min，18-21.5％B；75-80min，21.5-65％B；80-85min，65-95％B。

7.如权利要求1所述的黑龙骨茎叶指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述特征峰分别为：峰4为新绿原酸，峰8为绿原酸，峰9为咖啡酸，峰11为隐绿原酸，峰22为异槲皮苷，峰24为紫云英苷、峰28为异绿原酸C。

8.如权利要求1所述的黑龙骨茎叶指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤(6)中，所述结合聚类分析是将不同产地黑龙骨茎叶的共有峰导入SPSS26.0软件中进行聚类分析，以组间连接方法，选择欧式平方距离为聚类公式。

9.如权利要求1所述的黑龙骨茎叶指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤(6)中，所述主成分分析是将不同产地黑龙骨茎叶共有峰峰面积作为变量进行主成分分析，以特征值及方差贡献率为标准提取主成分，并制作碎石图，进一步进行黑龙骨茎叶主成分因子矩阵分析，最后将共有峰导入SIMCA14.0软件得到主成分得分图，采用SPSS软件计算主成分得分，以各主成分对应的方差贡献率为权重计算综合得分。

10.如权利要求1所述的黑龙骨茎叶指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤(6)中，所述偏最小二乘判别是在主成分分析基础上进行偏最小二乘判别分析，得到偏最小二乘判别分析得分图。

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【技术特征摘要】

2.如权利要求1所述的黑龙骨茎叶指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤(1)中，混合对照品溶液的制备：精密称取15-16mg新绿原酸、12-13mg绿原酸、12-13mg隐绿原酸置于10ml容量瓶中，加入75％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液①；另外精密称取2.5-3.6mg咖啡酸、5-6mg异槲皮苷、4.5-5.5mg紫云英苷、8-9mg异绿原酸c置于50ml容量瓶，加入75％乙醇至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液②；从混合对照品溶液①和合对照品溶液②中各吸取1ml置于同一10ml的容量瓶中，加入75％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液③。

3.如权利要求2所述的黑龙骨茎叶指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤(1)中，混合对照品溶液的制备：精密称取15.2mg新绿原酸、12.4mg绿原酸、12.6mg隐绿原酸置于10ml容量瓶中，加入75％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液①；另外精密称取3.1mg咖啡酸、5.6mg异槲皮苷、4.9mg紫云英苷、8.5mg异绿原酸c置于50ml容量瓶，加入75％乙醇至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液②；从混合对照品溶液①和合对照品溶液②中各吸取1ml置于同一10ml的容量瓶中，加入75％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液③。

4.如权利要求1所述的黑龙骨茎叶指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤(2)中，供试品溶液的制备：精密称取黑龙骨茎叶样品0.45-0.55g，置于20ml锥形瓶中，加入75％乙醇10ml，精密称重，超声提取25-35min，超声功率200w，超声频率40khz，放冷，补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

5.如权利要求4所述的黑龙骨茎叶指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘育辰，刘刚，周玲利，穆开朗，彭乐强，冉飞，
申请(专利权)人：贵州中医药大学，
类型：发明
国别省市：

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