【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物催化，具体涉及卤醇脱卤酶在催化合成手性四氢呋喃化合物中的应用，是一种利用卤醇脱卤酶进行立体选择性分子内亲核取代反应制备手性四氢呋喃化合物的方法。
技术介绍
1、手性四氢呋喃是重要的有机合成砌块，广泛存在于天然产物及生物活性分子的结构中。例如，腺苷酸活化蛋白激酶(ampk)的激活剂以及钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂empagliflozin等。手性四氢呋喃化合物的化学合成方法包括：直接利用手性底物进行的分子内亲核取代反应、以卤代酮为底物的不对称氢化结合威廉姆森醚合成反应，以及以消旋四氢呋喃化合物为底物的碳氢键氧化动力学拆分的策略等。然而，这些方法在实际应用中仍存在一定的局限性，例如，需要使用昂贵的手性前体、结构复杂的配体化合物，或者需要在低温、强碱性介质等严苛的反应条件下进行。
2、酶催化具有选择性优异、反应条件温和和生物相容性好等优势，在有机合成领域发挥着重要的作用。其中，卤醇脱卤酶(hhdhs)是一类兼具多种催化功能的酶，它们不仅能够催化邻位卤代醇的分子内脱卤的亲核取代反应，也能在亲核试剂存在的环境下，催化环氧化物的开环反应，可被用于多种环氧乙烷和双官能团醇化合物的立体选择性合成。然而，现有的卤醇脱卤酶研究均只涉及三元环氧化合物的合成或开环反应，将其用于催化体积大于三元环氧乙烷类手性环醚合成的实例尚未被报道。
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有合成手性四氢呋喃化合物技术上的不足，提供一种卤醇脱卤酶在催化合成手性四氢呋
2、为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
3、卤醇脱卤酶在催化以δ-卤代醇为底物合成手性四氢呋喃化合物中的应用。具体为使用卤醇脱卤酶催化δ-卤代醇分子内不对称亲核取代反应，形成手性四氢呋喃环化合物。所述的催化，以δ-卤代醇为底物。所述的δ-卤代醇，其结构式为：
4、
5、所述的手性四氢呋喃化合物，其结构式为：
6、
7、其中，r代表芳基，x代表卤素。
8、其中，所述的卤醇脱卤酶来源于放射形土壤杆菌agrobacterium radiobacter。优选为来源于放射形土壤杆菌agrobacterium radiobacter ad1的卤醇脱卤酶hhec。更优选地，所述的卤醇脱卤酶hhec的氨基酸序列如seq id no.1所示，其由核苷酸序列如seq idno.2所示的基因编码。
9、其中，所述卤醇脱卤酶以卤醇脱卤酶粗酶液的形式进行催化；所述的卤醇脱卤酶粗酶液，按照如下方法制备得到：将含卤醇脱卤酶的菌株经18-40℃发酵培养16-40h获得湿细胞，将湿细胞重悬于缓冲液，经裂解获得的上清液即为粗酶液；所述粗酶液的用量每μmolδ-卤代醇中加入0.16-0.2ml粗酶液计。所述的缓冲液为磷酸缓冲液(pbs)或tris-h2so4缓冲液中的任意一种；所述的缓冲液的ph为6.0-8.5，浓度为50-200mm；所述缓冲液的用量以每g湿细胞中加入4.45-5ml的缓冲液计。优选地，所述粗酶液的用量每μmolδ-卤代醇中加入0.16-0.18ml粗酶液计。所述的缓冲液为tris-h2so4缓冲液；所述的缓冲液的ph为8.5，浓度为150mm；所述缓冲液的用量以每g湿细胞中加入5ml的缓冲液计。
10、更优选地，粗酶液按照如下方法制备得到：将50μl甘油管储存的含卤醇脱卤酶的菌株接种于5ml lb培养基(34μg/ml卡那霉素)中，37℃、200rpm振荡培养12h；培养液以体积浓度1％接种量接种到tb培养基(34μg/ml卡那霉素)，37℃、200rpm振荡培养3h左右，至菌液od600＝0.6～0.8后，将菌液在4℃冷却1h后，加入0.3mm异丙基β-硫代半乳糖苷(iptg)诱导培养，20℃、200rpm培养16h。将诱导表达后的菌液在4℃、8000rpm离心10min，去除上清后获得湿细胞。将湿细胞重悬于缓冲液中(1g湿细胞置于5mltris-h2so4缓冲液中)，在-80℃冷冻保存。细胞反复冻融3次，然后通过超声裂解释放目标蛋白。将细胞裂解液在4℃、12000rpm离心30min，取上清液作为所述粗酶液。更优选地，所述的含卤醇脱卤酶的菌株为agrobacterium radiobacter ad1，所述菌株agrobacterium radiobacter ad1的详细信息见参考文献：de jong,r.m.；tiesinga,j.j.et al.structure and mechanism of abacterial haloalcohol dehalogenase:a new variation of the short-chaindehydrogenase/reductase fold without an nad(p)h binding site.embo j.2003,22(19),4933-4944.。
11、其中，所述的芳基选自未取代的苯基、至少一个氢被取代的苯基或杂芳基中的任意一种。所述的卤素选自氯或溴中的任意一种。
12、其中，所述的至少一个氢被取代的苯基，其取代基选自氯、溴、氟、甲基、甲氧基或叔丁基中的任意一种；所述的杂芳基为噻吩。
13、其中，所述的δ-卤代醇为4-氯-1-苯基-1-丁醇、4-氯-1-(4-氟苯基)-1-丁醇、4-氯-1-(4-溴苯基)-1-丁醇、4-氯-1-(4-氯苯基)-1-丁醇、4-氯-1-(4-甲苯基)-1-丁醇、4-氯-1-(4-甲氧基苯基)-1-丁醇、4-氯-1-(4-叔丁基苯基)-1-丁醇、4-氯-1-(2-甲苯基)-1-丁醇、4-氯-1-(3-甲苯基)-1-丁醇、4-氯-1-(3-甲氧基苯基)-1-丁醇、4-氯-1-(2-甲氧基苯基)-1-丁醇或4-氯-1-(2-噻吩基)-1-丁醇中的任意一种。优选地，所述的δ-卤代醇为4-氯-1-(4-氟苯基)-1-丁醇、4-氯-1-(4-氯苯基)-1-丁醇、4-氯-1-(4-溴苯基)-1-丁醇、4-氯-1-(4-甲氧基苯基)-1-丁醇或4-氯-1-(2-噻吩基)-1-丁醇中的任意一种。
14、优选地，δ-氯代醇按照如下步骤制备：
15、(1)制备氯代酮：在0℃、惰性气体保护氛围下，将weinreb酰胺(6mmol，1.0eq.)加入圆底烧瓶中，随后加入10ml四氢呋喃，将格氏试剂(9mmol，1.5eq.)逐滴加入反应体系。恢复至室温搅拌2小时，用10ml饱和nh4cl溶液淬灭反应。分离有机相，再使用乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，并用饱和氯化钠溶液洗涤有机相。分离并利用无水na2so4干燥有机相，真空条件下旋蒸除去有机溶剂得到粗产物。采用柱层析(硅胶)纯化，以石油醚/乙酸乙酯(20:1)为洗脱剂，纯化得到氯代酮类。
16、(2)制备消旋δ-氯代醇：将步骤(1)制备得到的氯代酮类(5mmol)置于圆底烧瓶中，向其中加入甲醇(20ml)，随后缓慢加入nabh4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.卤醇脱卤酶在催化合成手性四氢呋喃化合物中的应用，所述的催化，以δ-卤代醇为底物；所述的δ-卤代醇，其结构式为：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的卤醇脱卤酶来源于放射形土壤杆菌Agrobacterium radiobacter。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的卤醇脱卤酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述卤醇脱卤酶以卤醇脱卤酶粗酶液的形式进行催化；所述的卤醇脱卤酶粗酶液，按照如下方法制备得到：将含卤醇脱卤酶的菌株经18-40℃发酵培养16-40h获得湿细胞，将湿细胞重悬于缓冲液，经裂解获得的上清液即为粗酶液；
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的芳基选自未取代的苯基、至少一个氢被取代的苯基或杂芳基中的任意一种；所述的卤素选自氯或溴中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的至少一个氢被取代的苯基，其取代基选自氯、溴、氟、甲基、甲氧基或叔丁基中的任意一种；所述的杂芳基为噻吩。
7.根据权利要求
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的δ-卤代醇与助溶剂混合后经卤醇脱卤酶催化反应；所述助溶剂为乙腈、环己烷、二甲基亚砜或正己烷中的任意一种或几种的组合。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，每100μL助溶剂中混合2-11μmolδ-卤代醇。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的反应，反应温度为20-40℃，反应时间为0-3h。
...【技术特征摘要】
1.卤醇脱卤酶在催化合成手性四氢呋喃化合物中的应用，所述的催化，以δ-卤代醇为底物；所述的δ-卤代醇，其结构式为：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的卤醇脱卤酶来源于放射形土壤杆菌agrobacterium radiobacter。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的卤醇脱卤酶的氨基酸序列如seq idno.1所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述卤醇脱卤酶以卤醇脱卤酶粗酶液的形式进行催化；所述的卤醇脱卤酶粗酶液，按照如下方法制备得到：将含卤醇脱卤酶的菌株经18-40℃发酵培养16-40h获得湿细胞，将湿细胞重悬于缓冲液，经裂解获得的上清液即为粗酶液；
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的芳基选自未取代的苯基、至少一个氢被取代的苯基或杂芳基中的任意一种；所述的卤素选自氯或溴中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的至少一个氢被取代的苯基，其取代基选自氯、溴、氟、甲基、甲氧基或叔丁基中的任意一种；所述的杂芳基...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭凯，王文静，孔舒阳，彭永珍，胡玉静，赵明业，陈杰，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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