【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种磁性纳米颗粒免疫层析快速检测东方马脑炎病毒抗体的检测试剂盒及其制备方法，属于生物检测。
技术介绍
1、东方马脑炎(eastern equine encephalitis，eee)是一种典型的人兽共患病毒性疾病，该病毒属a组虫媒病毒披膜病毒科甲病毒属，含单股rna,因首先于病马脑组织中分离出病毒，故而得名。随后从病人脑组织中也分离出同样病毒，其引起的人类脑炎症状十分危急而凶险，其临床表现与乙型脑炎很相似，病死率约在35%以上。该病的典型表现为迅速发生的流感样症状，如头痛和发热，甚至有抽搐、意识障碍和脑膜刺激症状等。如果不加以治疗，伴中枢神经系统损害，预后不良，可能会导致35%的病例死亡。 东方马脑炎的预后与病变的范围和病情的轻重有关。脑部病变较局限且未侵犯"生命中枢"，病情较轻时，其预后往往良好。如昏迷持续时间较长，或有频繁惊厥时，脑部缺氧及病理变化加重，预后多较差，容易留有神经、精神的后遗症。
2、东方马脑炎病毒（eeev）经感染的蚊子的叮咬而由马传播给人；潜伏期大约在5月15日之间。主要的传播链是在鸟和蚊子之间。在夏之交到秋末冬初福建省脑病变类患者具有一定数量，病因不明，实验诊断尚无法普及开展，给临床上，尤其是神经内科造成很大困难，误诊误治也较多见。如何开发快速、有效的东方马脑炎病毒抗体检测试剂迫在眉睫。
技术实现思路
1、（一）要解决的技术问题
2、为了解决现有技术的上述问题，本专利技术提供一种磁性纳米颗粒免疫层析快速检测东方马脑炎病毒
3、（二）技术方案
4、为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：
5、一种磁性纳米颗粒免疫层析快速检测东方马脑炎病毒抗体的试剂盒，其包括由样品垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素检测膜及吸水垫依次搭接并贴在底衬卡构成的免疫层析试纸和磁性纳米颗粒捕获试剂，其中，所述硝酸纤维素检测膜上包被有兔抗e1蛋白多克隆抗体的质控线和东方马脑炎病毒e1蛋白的检测线，所述磁性纳米颗粒捕获试剂为东方马脑炎病毒e1蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米磁颗粒。
6、如上所述的试剂盒，优选地，所述东方马脑炎病毒e1蛋白的氨基酸序列如seq idno.1所示。
7、如上所述的试剂盒，优选地，所述东方马脑炎病毒e1蛋白的表达采用如seq idno.2所示基因序列进行。
8、如上所述的试剂盒，优选地，所述样品垫为含吐温-80的处理液进行浸泡处理后的玻璃纤维膜。
9、如上所述的试剂盒，优选地，所述玻璃纤维垫为经含有重量百分比为0.1%的tris碱、1.5%的bsa和2%的triton x-100的溶液浸泡过的玻璃纤维膜。
10、对免疫层析试纸中玻璃纤维垫不进行处理时，加入待测样品的稀释液时，会有少数试纸条出现假阳性，经大量实验验证，当将玻璃纤维垫采用0.1%的tris碱、1.5%的bsa和2%的triton x-100的溶液浸泡后，有效避免了假阳性的发生。
11、一种磁性纳米颗粒免疫层析快速检测东方马脑炎病毒抗体的试剂的制备方法，所述其包括如下步骤：
12、s1、将四氧化三铁磁性纳米磁颗粒羧基化后，加入东方马脑炎病毒e1蛋白进行标记，获得东方马脑炎病毒e1蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米磁颗粒捕获试剂；
13、s2、将玻璃纤维膜经重悬液浸泡后，干燥获得玻璃纤维垫；
14、s3、硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线，质控线上包被有兔抗e1蛋白多克隆抗体，检测线上包被有东方马脑炎病毒e1蛋白，获得硝酸纤维素检测膜；
15、s4、将玻璃纤维膜浸入含吐温-80的处理液中浸泡处理后，取出烘干，获得样品垫；
16、s5、将样品垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素检测膜、吸水垫依次搭接并贴在底衬卡组成，按硝酸纤维素检测膜上靠近质控线的一端覆盖上吸水垫，靠近检测线的另一端覆盖玻璃纤维垫进行贴条。
17、如上所述的制备方法，优选地，在步骤s1中，所述四氧化三铁磁性纳米磁颗粒的粒径大小为20nm，羧基化采用质量分数为30%的戊二醛溶液。
18、如上所述的制备方法，优选地，在步骤s1中，所述东方马脑炎病毒e1蛋白标记的浓度为1.8mg/ml，标记时反应时间为2.5h，磁吸附后弃去溶液，再加入0.75%的bsa溶液，摇晃封闭30分钟；磁吸附后弃去溶液，加入含0.05%的吐温-20浓度为0.01mol/l的pbs，洗涤；再加入重悬液，获得e1蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂溶液，其中，重悬液中含有重量百分比为0.1%的tris碱、1.5%的bsa和2%的triton x-100的溶液。
19、经大量实验证明，如果不采用含有0.75%的bsa溶液进行封闭，会有非特异性条带，出现假阳性结果。
20、如上所述的制备方法，优选地，所述东方马脑炎病毒e1蛋白的获得采用基因序列如seq id no.2进行表达制备。
21、如上所述的制备方法，优选地，在步骤s2中，所述重悬液为含有重量百分比为0.1%的tris碱、1.5%的bsa和2%的triton x-100的溶液。
22、如上所述的制备方法，优选地，在步骤s3中，所述兔抗e1蛋白多克隆抗体的包被浓度为2.2mg/ml和东方马脑炎病毒e1蛋白的包被浓度为1.8mg/ml。
23、本专利技术通过大量实验验证获得湿法免疫层析快速检测东方马脑炎病毒抗体的试剂。采用了磁性纳米颗粒捕获试剂为东方马脑炎病毒e1蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米磁颗粒，通过磁铁的吸附作用起到富集的作用，将待检测血清加入磁性纳米颗粒捕获试剂中，如果待测血清中有被感染东方马脑炎病毒产生的抗体时，抗体会与东方马脑炎病毒e1蛋白结合，而东方马脑炎病毒e1蛋白包被在四氧化三铁磁性纳米磁颗粒上，通过磁力架的磁力吸附的作用，会将抗体-东方马脑炎病毒e1蛋白-四氧化三铁磁性纳米磁颗粒的复合物吸附，此时弃去血清，达到富集抗体的目的。再将复合物重溶到100μl缓冲液，加入上述制备的免疫层析试纸的加样孔中，通过磁铁吸附富集有效提高了检测灵敏度。本专利技术还对样品垫进行了处理，通过大量实验发现，经过含有3%的吐温-80的0.05mol/l pbs处理过的样品垫，可有效避免假阴性的发生。因采用未处理的样品垫进行血清的检测时，会出现与条带上抗原结合不完全的现象，导致假阴性的发生。
24、本专利技术经过大量实验研究发现，磁性纳米颗粒捕获试剂采用重量百分比为0.1%的tris碱、1.5%的bsa和2%的triton x-100的重悬液时，采用该比例重悬液获得最优磁性颗粒分散度，并能有效避免非特异性条带出现，避免假阳性。
25、（三）有益效果
26、本专利技术的有益效果是：
27、本专利技术提供了一种东方马脑炎病毒e1蛋白，该蛋白可用做为抗原，用于检测东方马脑炎病毒抗体免疫试剂的制备。采用该东方马脑炎病毒e1蛋白制备的磁性纳米颗粒免疫层析快速检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种磁性纳米颗粒免疫层析快速检测东方马脑炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，其包括由样品垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素检测膜及吸水垫依次搭接并贴在底衬卡构成的免疫层析试纸和磁性纳米颗粒捕获试剂，其中，所述硝酸纤维素检测膜上包被有兔抗E1蛋白多克隆抗体的质控线和东方马脑炎病毒E1蛋白的检测线，所述磁性纳米颗粒捕获试剂为东方马脑炎病毒E1蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米磁颗粒。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述东方马脑炎病毒E1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述东方马脑炎病毒E1蛋白的表达采用如SEQ ID NO.2所示基因序列进行。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品垫为含吐温-80的处理液进行浸泡处理后的玻璃纤维膜。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述玻璃纤维垫为经含有重量百分比为0.1%的Tris碱、1.5%的BSA和2%的Triton X-100的溶液浸泡过的玻璃纤维膜。
6.一种磁性纳米颗粒免疫层析快速检测东方马脑炎病毒抗
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述四氧化三铁磁性纳米磁颗粒的粒径大小为20nm，羧基化采用质量分数30%的戊二醛溶液进行；
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述东方马脑炎病毒E1蛋白的获得采用基因序列如SEQ ID NO.2进行表达制备。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述重悬液为含有重量百分比为0.1%的Tris碱、1.5%的BSA和2%的Triton X-100的溶液。
10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述兔抗E1蛋白多克隆抗体的包被浓度为2.2mg/mL，东方马脑炎病毒E1蛋白的包被浓度为1.8mg/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种磁性纳米颗粒免疫层析快速检测东方马脑炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，其包括由样品垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素检测膜及吸水垫依次搭接并贴在底衬卡构成的免疫层析试纸和磁性纳米颗粒捕获试剂，其中，所述硝酸纤维素检测膜上包被有兔抗e1蛋白多克隆抗体的质控线和东方马脑炎病毒e1蛋白的检测线，所述磁性纳米颗粒捕获试剂为东方马脑炎病毒e1蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米磁颗粒。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述东方马脑炎病毒e1蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述东方马脑炎病毒e1蛋白的表达采用如seq id no.2所示基因序列进行。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品垫为含吐温-80的处理液进行浸泡处理后的玻璃纤维膜。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述玻璃纤维垫为经含有重量百分比为0.1%的tr...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨宇，常亮，孔维恒，赵婷婷，文海燕，赵相鹏，曹国庆，陈紫光，
申请(专利权)人：中国海关科学技术研究中心，
类型：发明
国别省市：
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