【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及一种高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法。
技术介绍
1、肺炎克雷伯菌是社区获得性感染和医院获得性感染常见的致病菌。肺炎克雷伯菌具有较厚的荚膜多糖，可有效地抑制中性粒细胞吞噬及抗生素的作用，从而更容易导致肺炎、血流感染及尿路感染等。
2、凝集素是一类非免疫来源的carbohydrate结合蛋白，可以特异性识别并可逆地结合carbohydrate，具有凝集细胞或沉淀多糖和糖缀合物的能力。豆科植物凝集素家族是凝集素家族的一员，主要存在于豆科植物的种子中，刀豆蛋白a (con a)作为该家族最著名的代表，因其多种生物学效应而日益受到关注。con a对甘露糖(mannose)和葡萄糖(glucose)具有特异性。con a通过特异性识别在许多血清和膜糖蛋白中作为“核心寡糖”一部分存在的α-连接甘露糖吸附固定细菌。
3、crispr/cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过rna引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割dna产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。crispr-cas系统具有高效识别核酸的能力，核酸靶标经扩增得到大量扩增子，激活cas酶的非特异性切割活性(反式切割)切割荧光探针是对目标物的检测，基于pcr-crispr的检测方法被开发并用于核酸诊断。
4、aie技术指的是一类在溶液中不发光或发光微弱的分子，在聚集状态或固体薄膜下发光显著增强的现象。aie方法是在核酸的基本扩增原理下，基于聚集诱导发光的原理实现对扩增反应的实
5、如中国专利技术专利（申请号为cn202311770952.7）公开了一种检测高毒力耐药肺炎克雷伯菌的方法，其采用环介导等温扩增、多重lamp反应等方法进行高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测，但其检测灵敏度不高且特异性不好，最低检测限为2.5×101cfu/ml。
6、对于现有技术而言，检测肺炎克雷伯菌的方法包括菌落形态、拉丝试验、线虫试验、中性粒细胞抗吞噬试验、血清抗性试验等，这些方法耗时较长、不能快速报告临床，容易延误病情，并且其检测灵敏度比较低，特异性不强，尤其对于来源相近的菌株，传统方法很难通过生理生化的方式加以区分。目前普遍还是采用传统pcr方法检测高毒力耐药肺炎克雷伯菌，但传统pcr方法所需的设备昂贵，步骤复杂，对人员要求高，不易大面积推广。因此开发一种高效、快速的肺炎克雷伯菌的检测方法是有必要的。
技术实现思路
1、针对现有肺炎克雷伯菌的检测方法的问题，本专利技术提出一种高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、一种高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，所述方法包括以下步骤：
3、s1、取预设量的磁性纳米粒子与刀豆蛋白a，通过刀豆蛋白a包被磁性纳米粒子，以得到刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物；
4、s2、将所述刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物投入待检测样本中，使用所述刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物富集肺炎克雷伯菌，以得到目标溶液；
5、s3、确定rpa反应体系，将所述目标溶液投入所述rpa反应体系中扩增肺炎克雷伯菌核酸，以得到rpa反应液；
6、s4、确定crispr cas12a检测体系，将所述rpa反应液投入所述crispr cas12a检测体系中切割扩增所得核酸，以得到检测溶液；
7、s5、将所述检测溶液在多功能酶标仪中检测15分钟，每分钟读1次数，以阴性对照组的荧光值加上3倍标准偏差作为检出限判定检测结果，或者在紫外下观察所述检测溶液的荧光颜色，若为绿色，则所述待检测样本中含有高毒力耐药肺炎克雷伯菌；
8、所述crispr cas12a检测体系包括cas12a蛋白、用于crispr cas12a反应的 peg- 344基因引物、用于crispr cas12a反应的 kpc-2基因引物、aiegens荧光探针、alegens报道子、双蒸水、反应缓冲液；
9、所述用于crispr cas12a反应的 peg-344基因引物的序列如seq id no.5所示，所述用于crispr cas12a反应的 kpc-2基因引物的序列如seq id no.6所示；
10、其中，seq id no.5所示的序列为：
11、taatttctactaagtgtagattcatcttccctctaattgcagta（seq id no.5）；
12、seq id no.6所示的序列为：
13、taatttctactaagtgtagatgcggctccatcggtgtgtacgcg（seq id no.6）。
14、根据本专利技术提出的高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，本专利技术的有益效果为：
15、首先，现有检测方法基于获得病原体后进行检测，费时费力、灵敏度低、无法在样本中直接检测，为了避开增菌培养耗时长的短板，有效提高检测效率，本专利技术提出通过磁分离技术直接捕获标本中的病原菌。在富集目标菌方面，现有技术中，免疫磁珠常用直接修饰的方式将抗体通过共价键与纳米磁珠的氨基、羧基等基团结合直接偶联于磁性纳米材料表面，进而靶向富集细菌，但这种修饰存在抗体定向不当、限制抗体的位点空间造成抗体修饰的纳米颗粒与病原体之间的结合效率低下的问题，导致捕获效率低的不足，抗体价格较高。本专利技术制备了刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物，利用生物素化的刀豆蛋白a通过生物素与链霉亲和素的色氨酸残基有机结合，然后刀豆蛋白a与肺炎克雷伯菌表面的糖蛋白相结合，消除了基质及常见菌的干扰，分离效率高，富集时间短；而且与免疫化纳米磁珠相比，刀豆蛋白a在复合物的合成过程中降低了成本，一步法耗时更短，缩短了整体的检测时间；
16、其次，在基因检测方面，本专利技术针对高毒力耐药肺炎克雷伯菌的毒力基因 peg-344和耐药基因 kpc-2设计了特异性引物组，通过优化反应体系，进行多重rpa反应，操作简便，增强的cas12a检测具有更好的稳定性，可以弥补rpa的低效率，假阳性等不足，使增强的cas12a检测达到令人满意的反应活性与特异性，同时设计并实现了rpa与cas12a检测的结合，可在恒温37℃或39℃下本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，步骤S1具体包括：
3.根据权利要求1所述的高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，步骤S2具体为：
4.根据权利要求1所述的高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，所述刀豆蛋白A-磁性纳米粒子复合物平均粒径为180nm，表面连有羧基。
5.根据权利要求1所述的高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，在步骤S3中，所述RPA反应体系包括RPA肺克peg-344上游扩增引物、RPA肺克peg-344下游扩增引物、RPA肺克kpc-2上游扩增引物、RPA肺克kpc-2下游扩增引物、Rehydration缓冲液、MgOAc溶液、水。
6.根据权利要求5所述的高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，所述RPA肺克peg-344上游扩增引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述RPA肺克peg-344下游扩增引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述RPA肺
7.根据权利要求1所述的高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，所述AIEgens荧光探针由修饰猝灭基团的dsDNA特异性负载AIEgens构成，其中，所述修饰猝灭基团的dsDNA具体为由SEQ ID NO.7所示的DNA和SEQ ID NO.8所示的DNA互补得到的dsDNA。
8.根据权利要求7所述的高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，所述修饰猝灭基团的dsDNA末端延伸的ssDNA用作肺炎克雷伯菌核酸激活的Cas12a反式切割位点。
...【技术特征摘要】
1.一种高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，步骤s1具体包括：
3.根据权利要求1所述的高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，步骤s2具体为：
4.根据权利要求1所述的高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，所述刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物平均粒径为180nm，表面连有羧基。
5.根据权利要求1所述的高毒力耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，在步骤s3中，所述rpa反应体系包括rpa肺克peg-344上游扩增引物、rpa肺克peg-344下游扩增引物、rpa肺克kpc-2上游扩增引物、rpa肺克kpc-2下游扩增引物、rehydration缓冲液、mgoac溶液、水。
6.根据权利要求5所述的高毒力耐药肺炎克雷伯菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋，魏丹丹，范琳萍，施博雯，张伟，向天新，孔蕴源，李叶，朱雨辰，李欣，唐楠，
申请(专利权)人：南昌大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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