【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，涉及一种葡萄糖磷酸变位酶基因rk pgm及其在提高红冬孢酵母（ rhodosporidium kratochvilovae）胞外多糖产量中的应用。
技术介绍
1、磷酸葡萄糖变位酶 (phosphoglucomutase pgm)在生物界中普遍存在，属于磷酸己糖变位酶家族。pgm具有重要的生物学活性。已有研究发现，pgm对碳代谢、细菌细胞形态、细菌致病性、细菌高效产氢、细菌脂多糖生物合成以及对维持酵母细胞内ca2+平衡有影响。尤其是pgm能够调控葡萄糖-1-磷酸 (g-1-p) 和葡萄糖-6-磷酸 (g-6-p) 之间的相互转化。一方面可以生成 g-6-p 经过不同的分解代谢途径产生atp和还原力；另一方面也可产生g-1-p进入糖原合成途径，合成 udp 葡萄糖，为多糖和核糖核苷酸的合成提供前体物质。同时多糖也是细胞壁合成必不可少的部分，pgm 突变株会导致磷酸葡萄糖聚合物合成异常，进而影响细胞内碳水化合物的合成和储存，为维持体内的渗透压稳态，细胞结构将发生改变。
2、目前，微生物多糖的研究大多集中在多糖的提取、纯化、结构和功能上，关于微生物多糖的合成代谢相关酶和途径的研究较少。在已报道的的微生物多糖合成代谢途径研究中，多数是研究细菌的，而真菌由于多糖合成过程涉及的酶、因子和前体物质比较多，过程更为复杂，因此研究得较少。有研究发现，通过改变真菌多糖合成相关酶的酶活或表达量能提高多糖的产量。在 g. lucidum 的研
3、酵母胞外多糖是酵母菌在代谢过程中分泌到胞外的一种多糖类物质，作为微生物多糖的一个大类，它易于培养基中提取，成本低且无毒环保，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、降低血清胆固醇以及免疫调节等多种生理活性，可作为免疫刺激和抗肿瘤药物开发，具有广阔的市场前景。
4、微生物胞外多糖是一种具有多种生物活性的大分子物质，已有研究者通过发酵调控优化或菌种改良使微生物多糖产量得到一定的提高。但由于真菌多糖糖供体合成途径并未完全明晰，其中关键酶特性解析也不完善，使得微生物多糖产量的大幅度提高仍存在瓶颈。因此，采用基因工程技术改造发酵菌株制备微生物胞外多糖成为了发酵胞外多糖的新方法。
5、目前，关于葡萄糖磷酸变位酶基因 pgm在促进红冬孢酵母生产胞外多糖鲜有报道。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种葡萄糖磷酸变位酶基因rk pgm，该基因是从红冬孢酵母（ rhodosporidium kratochvilovae）ym25235中分离得到，其核苷酸序列如seq id no:1所示，该基因序列长为1656bp，编码氨基酸序列如seq id no:2所示，将该基因与载体连接，转入红冬孢酵母细胞中，这个基因表达水平的提高促进了红冬孢酵母中胞外多糖的合成。
2、本专利技术目的通过以下技术方案实现：
3、1、从红冬孢酵母ym25235中提取总rna，然后反转录成cdna，以合成cdna为模板，采用扩增rk pgm的特异引物，通过聚合酶链式反应扩增获得目的序列，将载体prh2034进行双酶切、回收，用一步克隆法将目的片段和载体连接，获得连接产物重组质粒prhrkpgm，将重组质粒prhrkpgm转入大肠杆菌中，通过pcr筛选出阳性单克隆，重组质粒prhrkpgm用 bamhⅰ、 ecorⅴ两个限制性内切酶进行酶切验证，验证阳性的克隆子培养后提取质粒，测序，获得片段大小为1656bp的葡萄糖磷酸变位酶基因rk pgm；
4、2、利用peg介导的原生质体法将重组载体prhrkpgm转化至红冬孢酵母ym25235中，筛选转化子，获得含有prhrkpgm的过表达菌株，含有prhrkpgm的过表达菌株经ypd培养基（酵母浸粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%）培养，提取胞外多糖，利用苯酚硫酸法测定胞外多糖的产量。
5、本专利技术提供了一种生产胞外多糖的新方法，本专利技术通过基因工程手段对微生物进行改造，来提高微生物胞外多糖的产量，从红冬孢酵母ym25235提取的总rna反转录的cdna中分离得到葡萄糖磷酸变位酶基因rk pgm，红冬孢酵母ym25235中rk pgm基因的过表达引起细胞内这个基因的转录水平的提高；红冬孢酵母ym25235具有生产周期短、遗传稳定、生产安全等优点，本研究结果有助于阐明红冬孢酵母ym25235中产胞外多糖机制，为揭示微生物提高胞外多糖产量机制提供参考，对胞外多糖的生产提供良好的应用前景和经济效益，为胞外多糖合成发酵策略的高效制定提供依据；本专利技术方法简单，易操作。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种葡萄糖磷酸变位酶基因RkPGM，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的葡萄糖磷酸变位酶基因RkPGM在促进红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）生产胞外多糖中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖磷酸变位酶基因rkpgm，其核苷酸序列如seq id no:1所示。
2.权利要求1所述的葡萄糖磷...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈媛，黄蓉，王太申，张成梅，张琦，邱婧雯，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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