【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，具体涉及一种微量组织核糖核酸的提取方法及转录组测序方法。
技术介绍
1、转录组(transcriptome)是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的总rna的集合。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。
2、微量转录组测序是利用smart-seq2技术进行mrna的高效、无偏好扩增和高通量测序的技术，尤其适用于无法进行常规mrna测序的微量样本，通过对转录出来的全部mrna进行测序，在全面快速得到基因表达谱变化的同时，还可以根据序列信息精确地分析转录本的可变剪切及基因融合现象。其基本原理是通过设计oligo(dt)vn primer作为逆转录引物，利用mmlvrt的模板转换活性，在cdna的3′端添加一段接头序列，通过该接头序列进行反转录，生成cdna第一条链。当逆转录酶到达mrna 5′末端时，会连续在末端添加几个胞嘧啶(c)残基。然后添加tso引物，退火后结合在第一条链的3′端与poly(c)突出杂交，合成第二条链。得到的cdna经过pcr扩增，获得纳克级的dna，纯化后文库构建并测序。
3、现有的转录组技术对组织量要求较高，一般需要＞35mg的组织才能够提取足够的核糖核酸用于后续检测。在现实的实验过程中，一些珍贵组织样本难以达到普通转录组的组织量要求，导致转录组检测实验无法进行，阻碍了科学研究的开展。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、用于提取微量组织中核糖核酸的方法，包括如下步骤：
4、(1)微量组织目标细胞的收集：取组织细胞样本，加入裂解液对细胞进行裂解，得到细胞裂解液；
5、(2)总rna提取：步骤(1)所得细胞裂解液经离心、溶解、变性，得到总rna溶液；
6、所述裂解液包括buffer a和buffer b；所述buffer a为guscn；所述buffer b由nuclease-free water、ethanol、sodium acetate和glycogen按体积比140-160:580-620:15-25:1组成。
7、现有技术中存在采用细胞裂解液直接裂解细胞的案例，但是往往需要分很多步骤进行，而步骤越多核酸损耗就会越大。而本专利技术提出了一种“一步到位，一管到底”的核糖核酸提取方法，通过对微量细胞或组织样本提前孵育解离，再加入buffera进行孵育，孵育完成后直接加入bufferb过夜沉降核糖核酸，从而获取得到足量且高质量的总rna，克服了现有技术所存在的不同步骤运用的不同试剂之间的干扰、核酸损耗大等问题，实现了微量组织样本的提取，同时还满足了后续研究的需求。
8、进一步，所述微量组织包括动物视神经组织、结缔组织、上皮组织、肌肉组织、心肝脾肺肾组织中的任一种或多种。
9、进一步，新鲜待测组织采用如下方法进行处理：将新鲜待测组织立即包埋后进行冰冻切片，将切片进行甲酚紫染色，然后进行激光捕获显微切割，得到目标细胞样本。
10、进一步，所述guscn的浓度为10-20m，优选为14m。
11、作为优选，所述buffer b中，nuclease-free water、ethanol、sodium acetate和glycogen的体积比为150:600:20:1。
12、作为优选，所述buffer a的用量为50ul。
13、进一步，所述sodium acetate的浓度为1.0-2.0m，ph为6-7；所述glycogen的浓度为15-25mg/ml。
14、作为优选，所述sodium acetate的浓度为1.5m，ph为6.5；所述glycogen的浓度为20mg/ml。
15、进一步，步骤(1)中，细胞样本先加入buffer a在42℃条件下孵育15min进行裂解；裂解所得溶液经离心后加入buffer b，得到细胞裂解液。
16、进一步，步骤(2)中，采用混合液进行溶解，所述混合液由nuclease-free water、3′cds primer、dntp和rnase inhibitor按体积比2.51:1:1:0.5组成；所述3′cds primer的核苷酸序列如seq in no.1所示。
17、进一步，所述3′cds primer的浓度为10μm；所述dntp的浓度为10mm；所述rnaseinhibitor的浓度为40u/μl。
18、进一步，步骤(2)中，变性条件为：72℃孵育3min。
19、进一步，步骤(2)中，步骤(1)所得细胞裂解液在-80℃条件下放置过夜后，经高速离心得到核糖核酸沉淀，随后再进行溶解。
20、本专利技术的目的之二在于提供一种基于前述方法对微量组织进行转录组测序的方法，该方法克服了现有转录组技术要求供体组织总量＞35mg的缺陷，可以实现微量组织样本的转录组测序。
21、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
22、基于前述方法对微量组织进行转录组测序的方法，包括如下步骤：
23、(1)利用前述方法提取微量组织核糖核酸；
24、(2)采用smart-seq2技术对步骤(1)所得总rna溶液进行反转录及扩增富集，得到富集的cdna；
25、(3)利用步骤(2)所得cdna构建cdna文库并进行高通量测序。
26、进一步，步骤(2)包括如下步骤：
27、1)逆转录：向所述总rna溶液加入反应缓冲液后进行pcr反应，得到反应液；
28、2)cdna扩增和纯化：将步骤1)所得反应液加入pcr混合液中并进行扩增，纯化得到cdna。
29、进一步，步骤1)中，反应条件为：42℃90min、50℃2min、42℃2min、70℃15min，共进行10个循环；所述反应缓冲液由superscript ii reverse transcriptase、rnaseinhibitor、superscript ii first-strand buffer(5×)、dtt、betaine、mgcl2、lna-tso按体积比0.5：0.25：2：0.5：2：0.09：0.1组成；所述lna-tso的核苷酸序列如seq in no.2所示。
30、进一步，所述superscript ii reverse transcriptase的浓度为200u/μl；所述rnase inhibitor的浓度为40u/μl；所述dtt的浓度为100mm；所述betaine的浓度为5m；所述mgcl2的浓度为5m；所述lna-tso本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于提取微量组织中核糖核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微量组织包括动物视神经组织、结缔组织、上皮组织、肌肉组织、心肝脾肺肾组织中的任一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GuSCN的浓度为10-20M；所述Sodiumacetate的浓度为1.0-2.0M，pH为6-7；所述Glycogen的浓度为15-25mg/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，细胞样本先加入Buffer A在42℃条件下孵育15min进行裂解；裂解所得溶液经离心后加入Buffer B，得到细胞裂解液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用混合液进行溶解，所述混合液由Nuclease-free water、3′CDS primer、dNTP和RNase inhibitor按体积比2.51:1:1:0.5组成；所述3′CDS primer的核苷酸序列如SEQ IN NO.1所示。
6.基于权利要求1所述的方法对微量组织进行
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)中，反应条件为：42℃90min、50℃2min、42℃2min、70℃15min，共进行10个循环；所述反应缓冲液由SuperScript II
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)中，扩增条件为：98℃3min、98℃20sec、67℃15sec、72℃6min、72℃5min，共进行19个循环；所述PCR混合液由KAPA HiFiHotStart ReadyMix(2×)、A-IS PCR primers和Nuclease-free water按体积比15.2：1：1.5组成；所述A-IS PCR primers的核苷酸序列如SEQ IN NO.3所示。
10.用于微量组织核糖核酸提取的试剂组合物，其特征在于，所述试剂组合物包括Buffer
...【技术特征摘要】
1.用于提取微量组织中核糖核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微量组织包括动物视神经组织、结缔组织、上皮组织、肌肉组织、心肝脾肺肾组织中的任一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述guscn的浓度为10-20m；所述sodiumacetate的浓度为1.0-2.0m，ph为6-7；所述glycogen的浓度为15-25mg/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，细胞样本先加入buffer a在42℃条件下孵育15min进行裂解；裂解所得溶液经离心后加入buffer b，得到细胞裂解液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用混合液进行溶解，所述混合液由nuclease-free water、3′cds primer、dntp和rnase inhibitor按体积比2.51:1:1:0.5组成；所述3′cds primer的核苷酸序列如seq in no.1所示。...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐俊，张洁梅，
申请(专利权)人：重庆生命知源科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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