本发明专利技术公开了一种属于从棕色脂肪分离心脏干细胞及其成心肌分化的方法。该方法包括：（１）消化液的制备：将胶原酶、ｄｉｓｐａｓｅＩＩ？与胰酶以质量比１∶１∶０．５－１的比例溶于无血清的培养基中；（２）使用加有玻璃珠和转子的消化瓶消化棕色脂肪组织，然后离心收集细胞；（３）原代心脏干细胞的培养与成心肌细胞分化。本发明专利技术采用组合的消化酶液及其特殊的消化方法进行细胞分离，与现有的分离方法相比，该分离方法显著的提高了细胞的产率，同时心脏干细胞的含量也明显提高，可通过ＣＤ１３３的表达率与成心肌的能力得以验证，因此心脏干细胞的产率也显著提高。本方法获得的心脏干细胞产率高、操作简单、可实施性强，减少了人为操作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞的分离及其分化成组织细胞的方法，其体涉及。
技术介绍
心脏内在的再生机制非常有限，不足以补偿病理状态下的心肌细胞丢失，如心肌梗死。这使得科学家投入大量的研究去鉴定新的心肌细胞来源，以用于损伤心肌的修复与心脏功會g的改善(Wolfram-Hubertus Zimmerma皿等，Engineeredheart tissuegrafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts, NATUREMEDICINE, 2006， 12(4) :452-458 ;V. Planat-B6nard等，Sponta固usCardiomyocyteDifferentiation From Adipose Tissue Stroma Cells, Circ. Res. 2004,94 :223-229)。由于干细胞具有多能性，能够分化为其他类型的细胞，包括功能性的心肌细胞，因此受到广泛的研究。至今，已有多种干细胞来源被用于心肌再生研究，包括胚胎干细胞，骨骼肌成肌细胞，骨髓间充质干细胞等。然而，这些细胞在应用中都具有一定的局限性，如胚胎干细胞具有形成畸胎瘤的风险，骨骼成肌细胞存在诱发心律失常的隐患，骨髓来源干细胞向心肌的转分化问题还存在争论(Zongjin Li等，Imaging Survival and Function ofTransplantedCardiac Resident Stem Cells, JACC， 2009， 53 (14) :1229-1240)。这些问题使得寻找新的能够产生心肌细胞的成体干细胞源非常迫切。 近来，人们从心肌组织中分离到心脏干细胞(Antonio P. Beltrami等，AdultCardiac Stem Cells Are Multipotent and Support Myocardial Regeneration,Cell,2003，114，763-776 ;Alessandro Giacomello Latronico等，Isolation andExpansionof Adult Cardiac Stem Cells From Human and Murine Heart, Circ. Res.，2004,95 :911-921)。与其他成体干细胞不同，心脏干细胞是用于心肌再生的一种很适合的种子细胞，因为他们很可能按照自身的内在程序在体外产生心肌组织并在体内增加心肌组织的活力。因此，心脏干细胞在治疗心脏疾病方面为人们开辟了新的前景(Barile L等，Cardiac stem cells -isolation, expansion and experimental usefor myocardialregeneration, Nat Clin Pract Cardiovasc Med. ， 2007， S9—S14)。然而，目前对这禾中来源的细胞存在细胞收集上的技术困难，而且收集的细胞数量很小，这使得心肌部位的内源性的心脏干细胞并不适合用于移植(YoshihiroYamada等，Cardiac progenitor cells inbrown adipose tissue repaired d咖agedmyocardium， Biochemical and BiophysicalResearch Communications, 2006， (342) :662-670 ;Anke M Smits等，Human cardiomyocyteprogenitor cells differentiate intofunctional mature cardiomyocytes :an invitro model for studying human cardiacphysiology and pathophysiology, NATUREPROTOCOLS, 2009， 4 (2) :232-243)。因此，寻找一种在细胞治疗中可能利用的心脏干细胞来源就显得十分必要。 脂肪组织来至胚胎中胚层，包含一种异质的、易于分离的基质细胞群。这一组织在临床应用中丰富易的，一旦被成功开发利用，将可能在再生医学领域产生深远影响。因此，脂肪组织来源的细胞也被作为心肌再生的候选细胞被大量研究。Planat-Benard等 (V. Planat-B6nard等，Spontaneous CardiomyocyteDifferentiation From AdiposeTissue Stroma Cells, Circ. Res. 2004， 94 :223-229)首次报道了小鼠来源的脂肪细胞能够自发分化为心肌细胞，尽管分化效率很低(0. 02-0. 07% )，但是却表明了脂肪组织可能是心脏干/祖细胞的一种新来源。随后，Yamada等(Yoshihiro Yamada等，Cardiacprogenitor cells in brown adiposetissue repaired damaged myocardium,Biochemicaland Biophysical ResearchCommunications， 2006， (342) :662-670)进一步发现棕色脂肪组织来源的细胞成心肌分化潜能远高于这一水平(超过20% )，这明确表明了棕色脂肪组织是心脏干细胞的丰富来源。 棕色脂肪组织中心脏干细胞的发现为研究心肌的体外分化提供了新的模型，并为心肌再生提供了新的心肌细胞来源。然而，现有的从棕色脂肪分离心脏干细胞的方法是米用Dispase II消化(Yoshihiro Yamada等，Cardiac progenitorcells in brownadipose tissue repaired damaged myocardium,Biochemical andBiophysical ResearchCommunications,2006， (342) :662-670 ;Y0SHIHIR0YAMADA等，Cardiac Stem Cells inBrown Adipose Tissue Express CD133 andlnduce Bone Marrow NonhematopoieticCells to Differentiate into Cardiomyocytes， STEMCELLS，2007，25(5) :1326-1333 ;Pilgaard L等，Comparative analysis ofhighlydefined proteases for the isolationof adipose tissue-derived stem cells, Regen Med. ， 2008， 3 (5) :705-15)，效率较低，而经典的采用I型胶原酶从脂肪组织分离细胞的方法存在同样问题(V. Planat-B6nard等，SpontaneousCardiomyocyte Differentiation From Adipose Tissue Stroma Cel本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从棕色脂肪分离心脏干细胞及其成心肌分化的方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行： （１）消化液的制备 将胶原酶、ｄｉｓｐａｓｅⅡ与胰酶以质量比１∶１∶０．５－１的比例溶于无血清的培养基中，其中，胶原酶、ｄｉｓｐａｓｅⅡ和胰酶在无血清的培养其中的浓度均为０．５－２ｍｇ／ｍＬ，完全溶解后，调解ｐＨ至７．２－７．４，获得消化液； （２）来源于棕色脂肪的原代心脏干细胞的分离 将清洗并剪碎的棕色脂肪组织加入到含有上述消化液的消化瓶中，每１０毫升消化液加入０．５－１．０克棕色脂肪组织，加盖后放在磁力搅拌器上进行搅动，转速为８０－１２０ｒｐｍ，在３７℃，５％ＣＯ↓［２］的孵箱中消化４５－６０ｍｉｎ，然后以血清终止消化反应，其中，血清与消化液的体积比为１－２∶１０，将消化液过滤后离心收集细胞，即获得原代心脏干细胞；其中，所述消化瓶中装有玻璃珠和磁力搅拌转子； （３）原代心脏干细胞的培养与成心肌细胞分化 使用含血清的α－ＭＥＭ培养基重悬上述原代心脏干细胞，其中，血清的体积百分比浓度为１０％，然后以５×１０↑［３］－５×１０↑［４］／ｃｍ↑［２］的密度将原代心脏干细胞接种于组织培养基中进行培养分化，隔天换组织培养基，培养２－４周，心脏干细胞可分化为节律搏动的心肌细胞。...
【技术特征摘要】
一种从棕色脂肪分离心脏干细胞及其成心肌分化的方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行(1)消化液的制备将胶原酶、dispaseII与胰酶以质量比1∶1∶0.5-1的比例溶于无血清的培养基中，其中，胶原酶、dispaseII和胰酶在无血清的培养其中的浓度均为0.5-2mg/mL，完全溶解后，调解pH至7.2-7.4，获得消化液；(2)来源于棕色脂肪的原代心脏干细胞的分离将清洗并剪碎的棕色脂肪组织加入到含有上述消化液的消化瓶中，每10毫升消化液加入0.5-1.0克棕色脂肪组织，加盖后放在磁力搅拌器上进行搅动，转速为80-120rpm，在37℃，5％CO2的孵箱中消化45-60min，然后以血清终止消化反应，其中，血清与消化液的体积比为1-2∶10，将消化液过滤后离心收...
【专利技术属性】
技术研发人员：王常勇，刘志强，段翠密，周瑾，王海滨，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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