【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其是涉及一种苯乙烯双加氧酶突变体及其制备方法与应用。
技术介绍
1、香兰素(vani1lin)，化学名称为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，其香气幽雅、持久，是目前最常见的风味化学品之一，广泛的应用于食品和饮料、医药、日用化工等领域。每年约消耗12000吨香兰素，其中只有20～50吨从香兰豆中提取，其余是合成的。近年来，消费者们对于天然香料的呼声越来越高，导致天然香兰素的需求量也在大幅增长。
2、目前生产香兰素的方法有植物提取法、化学合成法和生物合成法。植物提取法从香兰豆中提取，但其产量较低且价格高昂；化学法合成的香兰素大剂量使用会导致头痛、呕吐，呼吸困难等不良反应，对人体危害较大；生物合成法在微生物细胞或酶的催化作用下，通过简单的生物转化或生物合成制备香兰素，与植物提取的香兰素等同，符合eu和fda对天然香精的使用安全要求。其转化前体主要有丁香酚、异丁香酚、香草醇、阿魏酸和芳香族氨基酸等天然化合物。异丁香酚是合成香兰素的最佳前体物质，而苯乙烯双加氧酶可特异性转化异丁香酚为香兰素，该方法合成出来的香兰素在香气上最接近于天然香兰素,因此引起广泛的关注。
3、苯乙烯双加氧酶(styrene dioxygenase)简称sdo，以异丁香酚为底物，在无需任何辅酶和辅因子的存在下，通过氧化裂解连接苯环的丙烯基从而生成香兰素。已在许多微生物中广泛报道通过异丁香酚转化生产香兰素，所述微生物包含黑曲霉(aspergillusniger)、枯草芽抱杆菌(bacillus subtilis)和恶臭假单胞菌
4、因此，在本领域中需要生产具有更高滴度和转化率的香兰素生产方法，更具成本效益的方法。
5、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一种苯乙烯双加氧酶突变体，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
2、本专利技术的目的之二在于提供一种编码上述的苯乙烯双加氧酶突变体的多核苷酸。
3、本专利技术的目的之三在于提供一种含有上述的多核苷酸的载体。
4、本专利技术的目的之四在于提供一种表达苯乙烯双加氧酶突变体的重组细胞。
5、本专利技术的目的之五在于提供一种构建上述的重组细胞的方法。
6、本专利技术的目的之六在于提供一种上述的重组细胞或上述的方法制备的重组细胞在生产苯乙烯双加氧酶或提高苯乙烯双加氧酶产量，或生产香兰素中的应用。
7、本专利技术的目的之七在于提供一种生产苯乙烯双加氧酶的方法。
8、本专利技术的目的之八在于提供一种生产香兰素的方法。
9、为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
10、第一方面，本专利技术提供了一种苯乙烯双加氧酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示，存在如下突变位点：第124位、第182位和第283位；
11、所述第124位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，所述第182位的酪氨酸突变为组氨酸，所述第283位的丝氨酸突变为苯丙氨酸。
12、第二方面，本专利技术提供了一种编码上述的苯乙烯双加氧酶突变体的多核苷酸；
13、优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no.2所示。
14、第三方面，本专利技术提供了一种含有上述的多核苷酸的载体；
15、优选地，所述载体为pet-22b(+)、pet-3a(+)、pet-3d(+)、pet-11a(+)、pet-12a(+)、pet-14b(+)、pet-15b(+)、pet-16b(+)、pet-17b(+)、pet-19b(+)、pet-20b(+)、pet-21a(+)、pet-23a(+)、pet-23b(+)、pet-24a(+)、pet-25b(+)、pet-26b(+)、pet-27b(+)、pet-28a(+)、pet-29a(+)、pet-30a(+)、pet-31b(+)、pet-32a(+)、pet-35b(+)、pet-38b(+)、pet-39b(+)、pet-40b(+)、pet-41a(+)、pet-41b(+)、pet-42a(+)、pet-43a(+)、pet-43b(+)、pet-44a(+)、pet-49b(+)、pqe2、pqe9、pqe30、pqe31、pqe32、pqe40、pqe70、pqe80、prset-a、prset-b、prset-c、pgex-5x-1、pgex-6p-1、pgex-6p2、pbv220、pbv221、pbv222、ptrc99a、ptwin1、pezz18、pkk232-18、puc18或puc19中的任意一种。
16、第四方面，本专利技术提供了一种表达苯乙烯双加氧酶突变体的重组细胞，所述重组细胞含有上述的多核苷酸或上述的重组载体，或表达上述的苯乙烯双加氧酶突变体。
17、第五方面，本专利技术提供了一种构建上述的重组细胞的方法，包括向生物细胞中导入上述的载体；
18、优选地，所述生物细胞包括原核细胞或真核细胞；
19、优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌bl21(de3)细胞、大肠杆菌bl21star(de3)plyss细胞或大肠杆菌rosetta(de3)细胞中的任意一种，优选为大肠杆菌bl21(de3)细胞；
20、优选地，所述真核细胞为酵母细胞。
21、第六方面，本专利技术提供了一种上述的重组细胞或上述的方法制备的重组细胞在如下任一种应用：
22、a、生产苯乙烯双加氧酶中的应用；
23、b、提高苯乙烯双加氧酶产量中的应用；
24、c、生产香兰素中的应用。
25、第七方面，本专利技术提供了一种生产苯乙烯双加氧酶的方法，包括培养上述的重组细胞或上述的方法制备的重组细胞，得到发酵产物，从所述发酵产物中得到苯乙烯双加氧酶；
26、优选地，所述培养上述的重组细胞或上述的方法制备的重组细胞包括将经活化后的所述重组细胞进行种子培养得到种子液，对种子液进行发酵培养；
27、优选地，所述种子液的od600为10～15；
28、优选地，所述对种子液进行发酵培养包括将种子液接种至发酵培养基中发酵培养；
29、优选地，所述发酵培养的条件包括培养温度为35～38℃，优选为37℃，培养液的溶氧量为30～50％；
30、优选地，所述对种子液进行发酵培养还包括当培养液的od600为15～20时加入诱导剂，得到发酵产物；
31、优选地，所述加入诱导剂后还包括将培养温度调整为25～30℃，优选为30℃，至培养液的od600为40～100，得到发酵产物；
32、优选地，所述诱导剂为iptg或乳糖，优选为iptg；<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种苯乙烯双加氧酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，存在如下突变位点：第124位、第182位和第283位；
2.编码权利要求1所述的苯乙烯双加氧酶突变体的多核苷酸；
3.一种含有权利要求2所述的多核苷酸的载体；
4.一种表达苯乙烯双加氧酶突变体的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体，或表达权利要求1所述的苯乙烯双加氧酶突变体。
5.一种构建权利要求4所述的重组细胞的方法，其特征在于，包括向生物细胞中导入权利要求3所述的载体；
6.权利要求4所述的重组细胞或权利要求5所述的方法制备的重组细胞在如下任一种应用：
7.一种生产苯乙烯双加氧酶的方法，其特征在于，包括培养权利要求4所述的重组细胞或权利要求5所述的方法制备的重组细胞，得到发酵产物，从所述发酵产物中得到苯乙烯双加氧酶；
8.一种生产香兰素的方法，其特征在于，包括取权利要求7所述的方法制备的苯乙烯双加氧酶，外源流加异丁香酚生产香兰素。
9.根据权
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括收集香兰素；
...【技术特征摘要】
1.一种苯乙烯双加氧酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示，存在如下突变位点：第124位、第182位和第283位；
2.编码权利要求1所述的苯乙烯双加氧酶突变体的多核苷酸；
3.一种含有权利要求2所述的多核苷酸的载体；
4.一种表达苯乙烯双加氧酶突变体的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体，或表达权利要求1所述的苯乙烯双加氧酶突变体。
5.一种构建权利要求4所述的重组细胞的方法，其特征在于，包括向生物细胞中导入权利要求3所述的载体；...
【专利技术属性】
技术研发人员：随树珍，席道义，袁志法，杨文，
申请(专利权)人：国药国际医药科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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