本发明专利技术涉及“苏云金芽孢杆菌ｃｒｙ１Ａｉ在抗虫中的用途、改造的ｍｃｒｙ１Ａｉ基因及应用”，属于生物技术领域。苏云金芽孢杆菌ｃｒｙ１Ａｉ对鳞翅目害虫具有高毒力，根据Ｃｒｙ１Ａｉ蛋白的杀虫活性区氨基酸序列设计合成了的改造基因ｍｃｒｙ１Ａｉ序列，更有利于植物表达，表达量最高可占总可溶蛋白的０．２３％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，特别是涉及苏云金芽孢杆菌crylAi的用途，以及改造 的mcrylAi基因及应用。
技术介绍
虫害是造成农作物减产的重要原因之一，减少虫害的损失是增加粮食与饲料作物 产量的重要途径。据统计全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害造成的损失达14%，直接 给农业生产造成的经济损失高达数千亿美元。我国每年因虫害造成的损失水稻减产10%、 小麦减产20%、棉花减产30%以上[夏启中，张明菊，抗植物虫害基因及其应用，鄂州大学 学报，2005，(5) :56-60.]。采用喷施化学农药和生物杀虫剂等防治手段固然可以减轻害 虫对农作物的为害，但化学农药造成环境污染，生物杀虫剂成本较高。长期以来，大量喷施 化学杀虫剂，不仅会增强害虫的抗药性，使益虫及其它生态区系遭受破坏，而且严重污染环 境，提高生产成本，破坏生态平衡。因此，减少杀虫剂使用量，发展现代植物保护技术，已成 为可持续发展农业中必须正视的课题之一。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏 阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒 性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有 活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)， 也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系 [Schnepf. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D. R., Dean. D. H. Bacillus thuringiensisand its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998,62(3) :775_806.]。自 1981 年 Schn印f 等克隆了 Bt 的第一个 ICPs 基 因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，截止2008年6月 已发现和克隆了 412种ICPs基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、 高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获 准应用，它使用的基因来自Bt crylAc.在接下来的几年里，转cryIAb基因的抗虫玉米，转 cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有crylAc/crylA 基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中， 由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2007年，全球转基因作物种 植面积增长率达12%，即增加1230万hm2，达到1. 143亿hm2 (2. 824亿英亩)。第一个12 年，转基因作物商业化给工业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效益。由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种 植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基 因组合来避免害虫抗药性上升的风险。因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基3因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫 对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。
技术实现思路
本专利技术提供一种苏云金芽孢杆菌crylAi在抗虫中的用途，其对小菜蛾、玉米 螟、棉铃虫、粉纹夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟等害虫具有高毒力；同时通过对苏云金芽孢杆菌 crylAi改造，得到苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白mcrylAi基因序列，以应用于转化微生物 和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。苏云金芽孢杆菌crylAi基因在抗鳞翅目害虫中的应用。所述应用是将苏云金芽孢杆菌crylAi基因表达的晶体蛋白用于杀灭鳞翅目害 虫。所述应用是将上述基因转入到微生物或植物，使之表达对鳞翅目害虫的毒性蛋 白。一种改造的mcrylAi基因，其具有如SEQ NO. 3所述的核苷酸序列。改造的mcrylAi基因在抗鳞翅目害虫中的应用。所述应用是将上述基因转入到微生物或植物，使之表达对鳞翅目害虫的毒性蛋 白。本专利技术发现菌株BTS6(保藏号CGMCC 3459)对鳞翅目害虫具有高毒力，从中克隆 得到一个基因，经测序(其核苷酸序列为SEQ NO. 1)发现，与公开的crylAi基因相似性为 100%。经实验证明，该基因蛋白(其氨基酸序列为SEQ NO. 2)对鳞翅目害虫具有高毒力， 从而可将其转化植物或微生物，使之表达蛋白杀灭鳞翅目害虫。根据CrylAi蛋白的杀虫活性区氨基酸序列设计合成了可以用于转基因植物开发 的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ N03所示，该改造基因mcrylAi用于转化玉米，CrylAi蛋 白的含量最高可占总可溶蛋白的0. 23 %。保藏信息分类命名苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis保藏号CGMCC3459保藏日期2009年11月23日保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号附图说明图 1，cryl 类 PCR-RFLP 鉴定图谱1，引物k3un2/k5un2扩增酶切条带；2，引物k3un3/k5un3扩增酶切条带；M，IOObp ladder图2，cryIAx阳性克隆PCR鉴定1,3. 6kb PCR 产物；2，阴性对照；Μ, λ /Eco 1301图3，CrylAx在大肠杆菌中的表达1，空白对照不可溶组分；2，表达菌株不可溶组分；3，空白对照可溶组分；4表达菌株可溶组分图4植物表达载体pUlAi的构建图5植物表达载体pUlAi的酶切鉴定M =Lamda DNA/Ecol301I 1 :pUlAi/Sac I+BamH I，2:pT8A/Sac I+BamH I 3 p3300-Ubi/Sac I+BamH I图6抗性植株PCR检测M :DM2000P :pUlAi CK 阴性对照 1 15 部分转基因植株图7PCR阳性植株中cryIAi蛋白占可溶性蛋白比例图8T0代转基因植株的玉米螟生物活性测定A，B 未转基因植株 C 转基因植株具体实施例方式实施例ICrylAi基因、蛋白功能1-1菌株BTS6杀虫活性测定将菌株接种到LB固体培养基上，培养72小时，至芽孢与晶体释放。将芽孢与晶体 用灭菌水洗下来，悬浮起来，稀释到1亿芽孢每毫升的浓度用于杀虫活性测定。以小菜蛾、 玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾为例，测定对鳞翅目害虫的杀虫活性。结果显示该浓度的芽孢晶 体混合物对小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟具有高活性。四种试虫的死亡率都为100%。1-2BTS6 菌株的 PCR-RFLP 鉴定1.利用两对 cryl 类鉴定引物 k3un2/k5un2，k3un3/k5un3 (Kuo, W. S. and Chak,本文档来自技高网...
【技术保护点】
苏云金芽孢杆菌ｃｒｙ１Ａｉ基因在抗鳞翅目害虫中的应用。
【技术特征摘要】
苏云金芽孢杆菌cry1Ai基因在抗鳞翅目害虫中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，是将苏云金芽孢杆菌cryIAi基因表达的晶体蛋白用于 杀灭鳞翅目害虫。3.根据权利要求1所述应用，是将上述基因转入到微生物或植物，使之表达对鳞翅目 害虫的毒性蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：束长龙，宋福平，张杰，黄大昉，何康来，粱革梅，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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