一种小麦叶锈菌单克隆抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术“一种小麦叶锈菌单克隆抗体及其制备方法与应用”，属于生物技术领域。本发明专利技术的单克隆抗体的制备方法包括抗原免疫动物、细胞融合制备杂交瘤细胞、杂交瘤细胞分泌单克隆抗体三个步骤，其特征在于所述抗原为小麦叶锈菌的夏孢子。用于检测小麦叶锈菌，具有特异性好、灵敏度高、操作简便快速的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术，特别是涉及一种小麦叶锈菌单克隆抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
小麦锈病包括至文病菌包括小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)、 小麦口十诱菌(Puccinia triticina f. sp. tritic)禾口小麦禾干诱菌(Puccicinia graminis f.sp. tritici)，是一类世界性禾谷类作物的重要病害。小麦锈病具有发生区域广、暴发性 强、流行频率高、危害损失重等特点，严重威胁着我国小麦的生产安全，而在我国以小麦条 锈病的发生最为广泛，是影响我国小麦生产安全的首要病害，主要发生在西北、西南、长江 中下游和华北等有关省(市、自治区)，每年发生面积约6000万亩，经大力防治后仍年均减 产小麦IO亿公斤左右；其次是小麦叶锈病，在西南和长江流域一带发生最重，华北和东北 地区每年也有较重危害，而小麦叶锈病中，小麦叶锈菌生理小种或致病类型以K1T、 THT两 个小种为主(四川农业大学，蒲志刚，硕士论文小麦叶锈菌群体毒性与DNA多态性关系分 析及生理小种分子鉴定研究2004)，；小麦秆锈病过去主要分布在东南沿海、长江流域和福 建、广东、广西的冬麦区及东北、内蒙古等春麦区发生流行(李振岐和曾士迈，2000)，通过 沿海地区病菌越冬菌源基地治理和洛夫林系统抗病品种的广泛种植，近30年来基本控制 了该病害的流行危害，但在西南、淮北和东北等局部地区每年仍有不同程度的发生。 病害的早期诊断检测是准确测报和有效防控的基础和前提。长期以来，锈病的诊 断主要基于病原菌的生物学及病害症状的特征，其预测预报主要基于定期、大规模的田间 病叶调查和室内病菌小种的活体分离、培养和鉴定。而条锈病和叶锈病的苗期症状区别不 甚明显，一些基层植保人员常常将二者混淆；在小麦锈病潜育阶段，寄主的发病症状不易观 察，难以界定初侵染的时期和规模。这些用于锈病诊断及病情测报的传统方法不仅耗时费 工，且其准确性和可靠度在很大程度上取决于调查测报人员的经验积累与技术水平，难以 满足病害的快速、高通量诊断检测实际需求。因此，有必要研发简单易行、灵敏准确的小麦 锈病快速诊断和检测技术，其于鉴别病害、提高病害预测预报的准确度均具有重要的理论 意义和实际应用价值。 目前，中国农业科学院植物保护研究所麦类病害实验室已经针对这一生产中面 临的实际问题，建立了小麦条锈菌和叶锈菌种的特异性分子诊断检测技术(Cao et al.， 2007 ;曹丽华等，2007)。然而，该类基于PCR扩增的病菌核酸检测技术不但需要配置一些特 殊仪器如PCR仪、凝胶电泳装置等，且对操作人员的技术水平要求较高，难以在众多基层植 保科技工作者和技术人员中推广应用。 单克隆抗体技术，是由单细胞系列产生的同一种抗体蛋白，其仅与抗原分子中的 一个抗原决定簇结合，故与抗原性物质反应时相对专一，不受其它物质干扰，能区别物种 间的细微差异。利用该方法检测病原菌具有诸多优点，如易于大量生产、可高通量检测、免 用标记物，较易实现病菌的快速、实时、实地检测(Ward et al. ， 2004 ;Werres&Steffens，1994)，促使其迅速在农学、医学和食品学中得到广泛应用。同时，该方法涉及的仪器化程 度较低、操作简便，特别是对样本前处理要求简单易于推广，国际上许多权威机构将其列 为优先发展的分析技术之一。因而，单克隆抗体技术是实现田间快速检测病原菌的好方 法(Danks&Barker，2000 ;Dewey et al. ， 1990 ;Ward et al. ，2004)。自上世纪80年代 以来，单克隆抗体技术已广泛应用于一些卵菌病原菌的生物学、分类学及致病性方面的研 究，诸如Phytophthora ci皿amomi (Hardhamet al. ， 1986 ;Gabor et al. ， 1993) ， Pythium aphanidermat咖(Estrada-Garcia et al. ，1989)， 及Aphanomyces invadans(Miles et al. ，2003)，且成功石开发了水生真菌Salmonella sp. ， Escherichiacoli、 Listeria monocytoenes(Bokken et al. ，2003 ;Fratamico et al. ，1998 ;Kouboves et al. ，2001; Leonard et al. ，2004)及几种细菌病原菌单克隆抗体检测技术(Ipbal et al. ，2000)。丹 麦农科院作为我们的合作伙伴，目前已经在小麦条锈菌的单克隆抗体研究方面取得了一些 进展(Skottrup et al. ，2007)，但其尚未对小麦叶锈菌的单克隆抗体制备方法进行报道。
技术实现思路
本专利技术针对小麦叶锈菌单克隆抗体检测的空白现状，提供一种小麦叶锈菌单克隆 抗体及其制备方法与应用，用于检测小麦叶锈菌，具有特异性好、灵敏度高、操作简便快速 的优点。 —种小麦叶锈菌(Puccinia triticina f. sp. tritic)的单克隆抗体，其制备方法 包括抗原免疫动物、细胞融合制备杂交瘤细胞、杂交瘤细胞分泌单克隆抗体三个步骤，其特 征在于所述抗原为小麦叶锈菌的夏孢子。 所述抗原为小麦叶锈菌生理小种PHT和/或THT的夏孢子。 所述抗原为小麦叶锈菌生理小种PHT的夏孢子和THT的夏孢子的等量混合物。 所述抗原免疫动物之前，先以弗氏佐剂乳化所述抗原。 所述动物为4 8周龄的Balb/C小鼠。 上述单克隆抗体在检测小麦叶锈病中的应用。 上述单克隆抗体的制备方法，步骤如下 (1)以小麦叶锈菌小种PHT和/或THT的夏孢子为抗原免疫小鼠，筛选出能分泌出 对小麦叶锈菌小种PHT和/或THT的夏孢子特异性反应的血清的小鼠， (2)取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性杂交瘤细胞， (3)从阳性杂交瘤细胞的培养液上清中或阳性杂交瘤细胞免疫小鼠制取的腹水中 分离单克隆抗体。 抗小麦叶锈菌raT、 THT的单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.3464。 本专利技术目的是为检测小麦叶锈病提供一种小麦叶锈菌单克隆抗体，其特点在于以 完全的小麦叶锈菌夏孢子为抗原对动物进行免疫、制备杂交瘤细胞、从杂交瘤细胞培养液 上清液中或杂交瘤细胞免疫小鼠抽取的腹水中分离纯化而得到单克隆抗体。以叶锈菌夏 孢子为抗原制得的该单克隆抗体专一识别小麦叶锈菌夏孢子(即幼苗期小麦携带的叶锈 菌)，能够鉴别小麦幼苗期麦苗的感染情况，使植保工作人员针对致病菌进行提早防治。获 得该单克隆抗体后，植保工作人员通过目前常规的ELISA方法就可预测和鉴定小麦是否感4染小麦叶锈菌，与其他种类致病菌的鉴定方法结合使用达到鉴别诊断的目的。根据本专利技术单克隆抗体的技术方案，本领域技术人员可以采用不同的单一的或者混合的小麦叶锈菌生理小种的夏孢子作为抗原，制备得到专一针对某些生理小种的单克隆抗体。 根据近些年来的文献报道，大多数年份中，我国小麦叶锈菌中致病类型以PHT、THT两个生理小种为主，因此本专利技术具体提供一种采用小麦叶锈菌生理小种PHT和/或THT的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小麦叶锈菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ　ｔｒｉｔｉｃｉｎａ　ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃ）的单克隆抗体，按以下步骤制得：抗原免疫动物、细胞融合制备杂交瘤细胞、杂交瘤细胞分泌单克隆抗体三个步骤，其特征在于所述抗原为小麦叶锈菌的夏孢子。

【技术特征摘要】
一种小麦叶锈菌(Puccinia triticina f.sp.tritic)的单克隆抗体，按以下步骤制得抗原免疫动物、细胞融合制备杂交瘤细胞、杂交瘤细胞分泌单克隆抗体三个步骤，其特征在于所述抗原为小麦叶锈菌的夏孢子。2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述抗原为小麦叶锈菌生理小种PHT和/或THT 的夏孢子。3. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，所述抗原为小麦叶锈菌生理小种PHT的夏孢子 和THT的夏孢子等量混合物。4. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述抗原免疫动物之前，先以弗氏佐剂乳化所 述抗原。5. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：高利，陈万权，刘太国，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]