【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是涉及一种tcr/bcr空间转录组测序的方法及其应用。
技术介绍
1、自从桑格专利技术的基于链终止法的第一代测序技术实现了首次基因组序列的测定，基于基因测序的分子生物学技术不断发展。而自从人类基因组计划启动以来，人们开始研发大规模、高通量、低成本、快速的基因测序方法，随之出现的是第二代测序技术(也称为高通量测序)。第二代测序技术作为目前最常用的基因测序手段，针对不同的测序目标，主要可以分为两类：bulk测序和单细胞测序(scrna-seq)，前者针对一个组织中整体的基因信息，可以反映该组织内部的基因表达水平和特征；后者则是将组织中的单个细胞分离分别进行测序，优势是可以展示每个细胞的基因表达水平，揭示该组织内部细胞类型的异质性。尽管单细胞测序已经可以实现对特定细胞的基因表达水平的描述，但缺失了该细胞在组织原位的位置信息。为了解决这一问题，空间转录组测序技术应运而生，该技术通过原位捕获目标区域的细胞的mrna，将空间位置信息和细胞的基因表达水平融合在一起，生成该组织区域的基因表达图谱，充分展示了细胞的空间异质性。目前，这一技术已经在动植物生命周期进程、人类的衰老、肿瘤、疾病机制和临床研究中有了广泛的应用。空间转录组技术中最为广泛应用的是基于测序的原位空间标签技术，通过将能够对应空间位置的条形码加入到测序序列中实现原位的rna的捕获，其中具有代表性的技术包括已经商业化的10x visium技术、华大基因stereo-seq技术以及发表于专业论文的slide-seq、slide-seqv2等技术。
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3、因此，亟需一种能充分捕获带有空间位置信息的tcr/bcr的vdj重排区域序列，并且低成本、适应于不同的测序平台、高可靠性和高准确性的空间转录组测序方法。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提供一种非诊断和/或治疗目的的tcr和/或bcr空间转录组测序方法。
2、本专利技术的tcr和/或bcr空间转录组测序方法能深入到tcr和/或bcr基因的vdj重排区域，克服了传统技术在提供基因表达信息时的局限性，从而可以更详细地了解和分析免疫细胞受体的vdj重排情况；本专利技术使用可以使用pe150测序方案，不依赖于特定测序平台，提高了测序平台选择的灵活性，并且能显著降低测序成本；本专利技术方法中以环化dna作为模板，减少了模板重组和嵌合的可能性，可以专注于目标区域的扩增，提高了序列捕获的准确性，并且通过优化文库构建，本专利技术能够更精确地扩增特定的tcr和/或bcr区域，减少了非特异性扩增的风险，在多样性检测、克隆类型的捕捉与分辨和tcr umi标记等方面取得更优的效果，并且具备较高的测序饱和度，整体上提高了测序结果的可靠性。
3、本专利技术还提供一种tcr和/或bcr空间转录组测序试剂盒。
4、本专利技术还提供上述tcr和/或bcr空间转录组测序方法和试剂盒的应用。
5、本专利技术的第一方面，提供一种非诊断和/或治疗目的的tcr和/或bcr空间转录组测序方法，包括以下步骤：
6、s1、使用空间转录组建库方法进行样本组织透化和捕获rna；
7、s2、样本rna反转录构建cdna文库；
8、s3、使用特异性引物1多重pcr扩增富集tcr和/或bcr基因；
9、s4、对富集的tcr和/或bcr基因的单链dna环化处理；
10、s5、使用特异性引物2多重pcr扩增tcr的cdr3区域，或bcr的cdr全长区域。
11、s6、pcr加上测序接头，上机测序。
12、根据本专利技术的具体实施方式，本专利技术提供的tcr和/或bcr空间转录组测序方法，至少具有如下有益效果：
13、(1)具有深入分析特定基因区域的能力：通过设计特异性pcr引物，本方案能够深入到如tcr的vdj重排区域的特定重要基因区域，克服了传统技术在提供基因表达信息时的局限性，这使得研究者可以更详细地了解和分析免疫细胞受体的vdj重排情况，为免疫系统的研究提供了更全面的基因表达信息。
14、(2)可以全面分析免疫细胞的多样性：通过富集tcr的cdr3区域以及bcr的cdr全长区域，本方案能够有效带有空间位置信息的tcr/bcr的vdj重排区域序列，提供对tcr和/或bcr的多样性的深入分析。尤其是在bcr建库测序中使用了特异性设计的引物池，针对bcr基因的不同区域进行优化设计，确保了bcr中cdr区域的全面覆盖，还通过多轮pcr扩增和环化处理，提高了扩增的特异性和效率以及测序数据的质量和可比性。bcr基因在b细胞发育过程中会经历体细胞超突变，这些变异在抗体多样性和亲和力成熟中起关键作用。cdr全长测序能够全面捕获这些超突变，提供详细的突变谱，有助于理解shm在抗体生成和功能中的作用。通过对全长bcr序列的功能注释，可以识别重要的功能性区域和关键突变位点。总的来说，本专利技术方案在多样性检测、克隆类型的捕捉与分辨和tcr umi标记等方面的检测技术效果优异，并且具备较高的测序饱和度。免疫细胞的多样性对于免疫系统的理解至关重要，本专利技术方案的优势在于能够全面而详细地分析这些关键区域，为免疫细胞分析提供了更全面的信息。
15、(3)具有测序平台的灵活性和低成本优势：本方案使用环化dna作为pcr模板，并可以采用pe150测序方案，不依赖于特定测序平台，从而提高了测序平台的灵活性。相对于一些技术紧密结合特定测序平台的情况，这种灵活性使得该技术可以更容易地在不同测序平台上应用。此外，采用pe150测序方案显著降低了测序成本，提高了经济效益。
16、(4)本方案对文库构建方案进行优化，以环化dna作为pcr模板，减少了模板重组和嵌合的可能性，专注于目标区域的扩增，提高了序列捕获的准确性。通过优化文库构建流程，本方案能够更精确地扩增特定的tcr和/本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种非诊断和/或治疗目的的TCR和/或BCR空间转录组测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的TCR和/或BCR空间转录组测序方法，其特征在于，所述步骤S1的样本经过OTC包埋和冰冻切片处理。
3.根据权利要求1所述的TCR和/或BCR空间转录组测序方法，其特征在于，所述步骤S1的捕获RNA为使用Oligo d(T)引物捕获RNA。
4.根据权利要求1所述的TCR和/或BCR空间转录组测序方法，其特征在于，所述步骤S3的特异性引物1包括正向引物和反向引物；所述正向引物为引物池。
5.根据权利要求4所述的TCR和/或BCR空间转录组测序方法，其特征在于，所述引物池为购自泛因医学的货号为R0022M的试剂盒中的引物池，或货号为R0013M和R0061M的试剂盒中的引物池。
6.根据权利要求1所述的TCR和/或BCR空间转录组测序方法，其特征在于，所述步骤S4的环化处理为使用环化试剂盒进行环化处理。
7.根据权利要求1所述的TCR和/或BCR空间转录组测序方法，其特征在于，所述步骤S5的特
8.根据权利要求1所述的TCR和/或BCR空间转录组测序方法，其特征在于，所述步骤S6的PCR加上测序接头的序列包括Adapter序列、Index序列和Read2序列。
9.一种TCR和/或BCR空间转录组测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用的测序方法为权利要求1～8任一项所述的TCR和/或BCR空间转录组测序方法。
10.如权利要求1～8任一项所述的TCR和/或BCR空间转录组测序方法或权利要求9所述的试剂盒在TCR和/或BCR转录组测序中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种非诊断和/或治疗目的的tcr和/或bcr空间转录组测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的tcr和/或bcr空间转录组测序方法，其特征在于，所述步骤s1的样本经过otc包埋和冰冻切片处理。
3.根据权利要求1所述的tcr和/或bcr空间转录组测序方法，其特征在于，所述步骤s1的捕获rna为使用oligo d(t)引物捕获rna。
4.根据权利要求1所述的tcr和/或bcr空间转录组测序方法，其特征在于，所述步骤s3的特异性引物1包括正向引物和反向引物；所述正向引物为引物池。
5.根据权利要求4所述的tcr和/或bcr空间转录组测序方法，其特征在于，所述引物池为购自泛因医学的货号为r0022m的试剂盒中的引物池，或货号为r0013m和r0061m的试剂盒中的引物池。
【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓，胡哲瑜，郭丹妮，王修远，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：
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