【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，具体涉及一种扩增靶标的多重pcr引物组及方法。
技术介绍
1、在基于ngs测序的靶向测序中，为实现对一段较长靶标的全长捕获，常规会将该长靶标分为若干端ngs可以测通的小靶标。实际过程中，为消除引物覆盖部分靶标位置而导致部分目的靶标无法扩增的影响，常常将上述小靶标设计成头尾相搭形成重叠扩增子而非头尾相连扩增子。但重叠扩增子将会带来较大问题，如f1和r1扩增1号扩增子，f2与r2扩增2号扩增子，1号扩增子与2号扩增子有重叠部分，f2与r1将形成优势扩增产生大量的短扩增子即可能只扩增出1号扩增子与2号扩增子的重叠部分。实际过程中，技术人员为消除上述影响，会将上述扩增引物完全剥离到数个不同的反应体系中，也就是常见的分管扩增或分液滴扩增。显而易见，分管扩增带来成本及操作复杂度的成倍增长，而分液滴的扩增也需要匹配昂贵的数字pcr仪器或其他微液滴生成仪器，十分不便。
2、在多重靶向扩增中，由于目标捕获的区域长度的不同，扩增引物往往从数对到数百上千对，但最终各个扩增子的扩增效果千差万别。目前为解决上述问题，最常见的是分管进行扩增，退火温度接近的合为一管。此外引物修饰也是一种改善引物退火温度的方法，但实际操作中，引物修饰复杂而昂贵且往往效果不佳。
技术实现思路
1、基于此，有必要提供一种扩增靶标的多重pcr引物组，能够实现一管扩增重叠靶标，使重叠引物的短扩增子形成茎环结构抑制其扩增。进一步提供一种扩增靶标的多重pcr方法使各引物组合均在较为适宜的反应条件中实现了扩增子的均
2、具体技术方案如下：
3、一种扩增靶标的多重pcr引物组，所述多重pcr引物组包括至少两组引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述引物对适于扩增所述靶标中至少两个重叠的所需的扩增子，使得有可能在重叠区域中形成至少一个非所需的扩增子；
4、每条引物包括通用引物和特异性引物，所述特异性引物能够与靶标特异性结合；所述特异性引物为特异性正向引物或特异性反向引物；
5、扩增所需的扩增子的正向引物和反向引物中的通用引物不同；扩增非所需的扩增子的正向引物和反向引物中的通用引物相同，使得非所需的扩增子两端序列互补形成茎环结构抑制其扩增。
6、在其中一个实施例中，所述通用引物选自illumina、mgiseq、life ion、pacbio或nanopore中的一种测序平台使用的通用测序引物的全长或部分。
7、在其中一个实施例中，所述通用引物的长度为5-60bp，可选为10-40bp；
8、在其中一个实施例中，所述特异性引物的长度为10-30bp，可选，15-25bp。
9、在其中一个实施例中，所述通用引物选自illumina测序平台使用的通用测序引物的全长或部分，其通用测序引物为：
10、r1:acactctttccctacacgacgctcttccgatct，
11、r2:gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct。
12、一种扩增靶标的多重pcr方法，包括采用所述的引物组进行扩增，使得在重叠区域中形成的非所需的扩增子的两端序列互补形成茎环结构抑制其扩增。
13、在其中一个实施例中，所述扩增的程序包括预变性，第一阶段扩增，第二阶段扩增和延伸；其中，所述第一阶段扩增得到带有通用引物序列的产物，所述第一阶段扩增的程序包括解链、退火、延伸；
14、以所述第一阶段扩增得到的产物为模板进行所述第二阶段扩增，所述第二阶段扩增的程序包括解链、退火延伸。
15、在其中一个实施例中，所述第一阶段扩增利用引物中的特异性引物进行退火延伸；可选地，所述第一阶段扩增的退火温度为特异性引物的tm值±5℃组成的范围；可选地，所述第一阶段扩增中的退火为梯度退火，所述梯度退火的温度范围覆盖所有引物对中特异性引物的最佳退火温度；进一步可选地，所述梯度退火的温度由高到低设置。
16、在其中一个实施例中，所述第二阶段扩增利用引物中的通用引物及特异性引物进行退火延伸，所述第二阶段扩增的退火延伸温度比第一阶段的退火温度高。
17、在其中一个实施例中，所述第一阶段扩增或第二阶段扩增的循环次数至少为2次。
18、所述多重pcr引物组或所述多重pcr方法在构建高通量测序文库中的应用。
19、相对于传统技术，本申请具备如下有益效果：
20、根据本申请设计的引物组能够实现一管扩增多重靶标，特别是重叠靶标的扩增，抑制重叠扩增子的扩增，解决多重pcr反应中的非特异性扩增。本申请还提供了一种多重pcr方法，该方法降低了引物设计的要求，解决了多重靶向扩增中各扩增引物扩增效果不一的问题，提升了整体扩增子的扩增均一性。
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1.一种扩增靶标的多重PCR引物组，其特征在于，所述多重PCR引物组包括至少两组引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述引物对适于扩增所述靶标中至少两个重叠的所需的扩增子，使得有可能在重叠区域中形成至少一个非所需的扩增子；
2.根据权利要求1所述的多重PCR引物组，其特征在于，所述通用引物选自illumina、MGIseq、Life Ion、Pacbio或Nanopore中的一种测序平台使用的通用测序引物的全长或部分。
3.根据权利要求1或2所述的多重PCR引物组，其特征在于，所述通用引物的长度为5-60bp，可选为10-40bp；
4.根据权利要求3所述的多重PCR引物组，其特征在于，所述通用引物选自illumina测序平台使用的通用测序引物的全长或部分，其通用测序引物为：
5.一种扩增靶标的多重PCR方法，其特征在于，包括采用权利要求1-4任一项所述的引物组进行扩增，使得在重叠区域中形成的非所需的扩增子的两端序列互补形成茎环结构抑制其扩增。
6.根据权利要求5所述的多重PCR方法，其特征在于，所述扩增的程序包括
7.根据权利要求6所述的多重PCR方法，其特征在于，所述第一阶段扩增利用引物中的特异性引物进行退火延伸；
8.根据权利要求7所述的多重PCR方法，其特征在于，所述第二阶段扩增利用引物中的通用引物及特异性引物进行退火延伸，所述第二阶段扩增的退火延伸温度比第一阶段的退火温度高。
9.根据权利要求6-8任一项所述的多重PCR方法，其特征在于，所述第一阶段扩增或第二阶段扩增的循环次数至少为2次。
10.权利要求1-4任一项所述多重PCR引物组或权利要求5-9任一项所述多重PCR方法在构建高通量测序文库中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种扩增靶标的多重pcr引物组，其特征在于，所述多重pcr引物组包括至少两组引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述引物对适于扩增所述靶标中至少两个重叠的所需的扩增子，使得有可能在重叠区域中形成至少一个非所需的扩增子；
2.根据权利要求1所述的多重pcr引物组，其特征在于，所述通用引物选自illumina、mgiseq、life ion、pacbio或nanopore中的一种测序平台使用的通用测序引物的全长或部分。
3.根据权利要求1或2所述的多重pcr引物组，其特征在于，所述通用引物的长度为5-60bp，可选为10-40bp；
4.根据权利要求3所述的多重pcr引物组，其特征在于，所述通用引物选自illumina测序平台使用的通用测序引物的全长或部分，其通用测序引物为：
5.一种扩增靶标的多重pcr方法，其特征在于，包括采用权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯兵，曾祥拱，唐琼丽，谢槟，
申请(专利权)人：深圳市大道测序生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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