【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞生物学及临床医学，涉及一种通过ipsc途径的多谱系人肝脏类器官全阶段3d培养构建方法。
技术介绍
1、肝脏类器官的出现极大地促进了不同类型肝脏疾病的研究进展，人肝脏类器官表现出相似结构和功能，被认为具有还原人肝脏完整功能的潜力，不仅为研究人肝脏疾病提供了新的模型，且使用多谱系肝脏类器官移植来治疗肝脏疾病在临床医学上具有巨大的应用前景。
2、随着对肝脏类器官构建技术的日益成熟，不同体系的肝脏类器官培养方法陆续被建立。目前已出现的技术均采取前期2d培养，中后期3d培养的模式。然而，人肝脏类器官培养过程中却存在着大小均匀度较低，且随着传代次数的增多，类器官的成球能力减弱，类器官传代后存活率降低等问题。
技术实现思路
1、针对现有技术的缺陷或不足，本专利技术提供了一种ipsc途径的人肝脏类器官全阶段3d培养构建方法。
2、为此，本专利技术所提供的ipsc途径的人肝脏类器官全阶段3d培养构建方法包括：
3、步骤1，将bme、advanced dmem/f12和复苏后的人胚胎干细胞混合构建3d培养骨架；之后向3d培养骨架中添加含activin a、rhbmp-4、b27和rock的基础培养液a进行培养，诱导类器官向内胚层分化；所述基础培养液a为含有its-plus、a83-01、n21、n-acetylcysteine和hepes的rpmi1640培养基；
4、步骤2，将步骤1培养体系中的培养液更换为含rhbmp-4、rhfg
5、步骤3，将步骤2培养体系中的培养液更换为含rhbmp-4和b27的基础培养液b继续培养，诱导向前肠分化；
6、步骤4，将步骤3培养体系中的培养液更换为含rhhgf的基础培养液c继续培养，诱导类器官向成肝细胞分化；所述基础培养液c为含有its-plus、a83-01、n21、n-acetylcysteine和hepes的hcm培养基；
7、步骤5，将步骤4培养体系中的培养液更换为含rhhgf、dexamethasone和rhosm的基础培养液c继续培养，促进细胞分裂和生长；
8、步骤6，将步骤5培养体系的培养液更换为含rhkgf/fgf-7的基础培养液c继续培养，诱导类器官分化形成胆管细胞，生长为成熟的多谱系人肝脏类器官。
9、进一步的方案中，本专利技术的方法还包括：利用步骤6获得的人肝脏类器官进行传代培养。进一步可选的是，步骤6获得的肝脏类器官以1:4-6的比例进行传代，每代培养周期为10-13天；当类器官生长密度达到70％-80％或大小达到200-300μm时，进行下一代培养。
10、可选的方案是，所述人胚胎干细胞选自人胚胎干细胞h9。
11、可选的方案是，人胚胎干细胞h9复苏用培养液为mtesr完全培养液。
12、可选的方案是，所述复苏后的人胚胎干细胞生长密度为75％-85％。
13、可选的方案是，所述基础培养液a的配方为：每毫升rpmi 1640培养基中含有1xits-plus、5μm a83-01、1x n21、1.25mm n-acetylcysteine和100x hepes；
14、步骤1所用培养液配方为：每毫升型基础培养液a中含有：100ng/ml activin a、50ng/ml rhbmp-4、1％b27和5000x rock；
15、所述基础培养液b的配方为：每毫升advanced dmem/f12培养基中含有：1x its-plus、5μm a83-01、1x n21、1.25mm n-acetylcysteine和100x hepes；
16、步骤2所用培养液配方为：每毫升基础培养液b中含有：50ng/ml rhbmp-4、500ng/ml rhfgf-4、3μm chir 99021和1％b27；
17、步骤3所用培养液配方为：每毫升基础培养液b中含有：50ng/ml rhbmp-4和1％b27；
18、所述基础培养液c的配方为：每毫升hcm培养基中含有1x its-plus、5μm a83-01、1x n21、1.25mm n-acetylcysteine和100x hepes；
19、步骤4所用培养液配方为：每毫升基础培养液c中含有：50ng/ml rhhgf和0.1μmdexamethasone；
20、步骤5所用培养液配方为：每毫升基础培养液c中含有：20ng/ml rhhgf、0.1μmdexamethasone和20ng/ml rhosm；
21、步骤6所用培养液配方为：每毫升基础培养液c中含有：50ng/ml rhkgf/fgf-7。
22、可选的方案是，步骤1培养时长为3天；步骤2培养时长为3天；步骤3培养时长为2天；步骤4培养时长为4天；步骤5培养时长为4天；步骤6培养时长为8天。
23、本专利技术至少解决了现有技术中存在人肝脏类器官培养过程中出现的大小均匀度较低，经过传代后出现的成球能力减弱，类器官传代后存活率降低等问题。本专利技术提升了通过ipsc途径培养形成的人肝脏类器官传代后的类器官成球能力和存活率，以及类器官的可传代数。
24、现有技术ouchi,r.,et al.,modeling steatohepatitis in humans withpluripotent stem cell-derived organoids.cell metab,2019.30(2):p.374-384.e6通过游离脂肪酸环境构建脂肪肝炎症类器官，其结果说明了硬化和纤维化的关联性以及实验结果表明fxr激动剂介导的活性氧抑制可作为治疗脂肪性肝炎的治疗手段之一。该文献中的方案选择了在类器官二维培养的第六天进行构建细胞骨架。
25、现有技术wang,s.,et al.,human esc-derived expandable hepatic organoidsenable therapeutic liver repopulation and pathophysiological modeling ofalcoholic liver injury.cell res,2019.29(12):p.1009-1026通过建立新的培养体系可增加肝类器官的扩增能力，且建立了衍生模型，模拟酒精性脂肪肝的病理生理变化。其具体方案选择了在类器官二维培养的第八天进行构建细胞骨架。
26、相对于上述现有技术，本专利技术通过采用全阶段3d培养的创新性，为类器官的生长提供一稳定的培养环境来解决类器官传代导致的成球能力减弱，可传代数减少的问题，极大地维持了类器官的增殖潜力本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种iPSC途径的人肝脏类器官全阶段3D培养构建方法，其特征在于，方法包括：
2.根据权利要求1所述的人肝脏类器官全阶段3D培养构建方法，其特征在于，方法还包括：利用步骤6获得的人肝脏类器官进行传代培养。
3.根据权利要求2所述的人肝脏类器官全阶段3D培养构建方法，其特征在于，方法还包括：步骤6获得的肝脏类器官以1:4-6的比例进行传代，每代培养周期为10-13天；当类器官生长密度达到70％-80％或大小达到200-300μm时，进行下一代培养。
4.根据权利要求1所述的人肝脏类器官全阶段3D培养构建方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞选自人胚胎干细胞H9。
5.根据权利要求4所述的人肝脏类器官全阶段3D培养构建方法，其特征在于，人胚胎干细胞H9复苏用培养液为mTeSR完全培养液。
6.根据权利要求1所述的人肝脏类器官全阶段3D培养构建方法，其特征在于，所述复苏后的人胚胎干细胞生长密度为75％-85％。
7.根据权利要求1所述的人肝脏类器官全阶段3D培养构建方法，其特征在于，所述基础培养液A的配方为：每毫升
8.根据权利要求7所述的人肝脏类器官全阶段3D培养构建方法，其特征在于，步骤1培养时长为3天；步骤2培养时长为3天；步骤3培养时长为2天；步骤4培养时长为4天；步骤5培养时长为4天；步骤6培养时长为8天。
...【技术特征摘要】
1.一种ipsc途径的人肝脏类器官全阶段3d培养构建方法，其特征在于，方法包括：
2.根据权利要求1所述的人肝脏类器官全阶段3d培养构建方法，其特征在于，方法还包括：利用步骤6获得的人肝脏类器官进行传代培养。
3.根据权利要求2所述的人肝脏类器官全阶段3d培养构建方法，其特征在于，方法还包括：步骤6获得的肝脏类器官以1:4-6的比例进行传代，每代培养周期为10-13天；当类器官生长密度达到70％-80％或大小达到200-300μm时，进行下一代培养。
4.根据权利要求1所述的人肝脏类器官全阶段3d培养构建方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞选自人胚胎干细胞h9。
5.根据权利要求4所述的人肝脏类器官全阶段3d培养构建方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴江维，马俊林，张晓，陈家豪，裴浩宇，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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