【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本披露涉及wnt六肽foxy-5的新的、高可溶性组合物。本披露进一步涉及用于生产所述组合物的方法及其稳定性评估。
技术介绍
1、foxy-5是甲酰化的、wnt5a衍生的六肽和wnt5a模拟物，具有潜在的抗转移活性，目前正在作为候选药物研发以预防几种常见形式的癌症中的肿瘤扩散和复发。foxy-5具有式for-met-asp-gly-cys-glu-leu-oh(seq_no1，图1)。
2、静脉内施用后，foxy-5结合并激活wnt5a受体，主要是frizzled家族，从而激活wnt5a介导的信号传导。
3、foxy-5旨在补偿在患有其中wnt5a配体作为癌症抑制因子的癌症类型的患者中注意到的肿瘤组织中蛋白质wnt5a的缺乏，以降低转移的风险。最近一项对iii期结肠直肠癌患者的回顾性研究的子分析显示，wnt5a低表达患者的比例明显高于对ii期结肠直肠癌(crc)患者的先前研究中所观察到的。crc iii期肿瘤患者与ii期患者的不同之处主要在于，在与原发性肿瘤相邻的淋巴结中存在肿瘤细胞，因此更具侵袭性且进展更快。在近70％的iii期患者中观察到低水平的wnt5a，相比之下，肿瘤进展期较低的患者情况下的比例为约45％。在乳腺癌组织中也有类似发现，其中在70％的侵袭性三阴性乳腺癌中观察到wnt5a缺失或低水平，与此相比，在侵袭性较低的乳腺癌类型中为大约45％。在几种类型的癌症中，包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和肝细胞癌，已经证明，与具有正常或接近正常的wnt5a蛋白表达的肿瘤相比，原发性肿瘤中wnt5a的缺乏或低水
4、基于利用foxy-5已完成的旨在记录候选药物的安全特性、药代动力学和2期的剂量确定的1b期研究，foxy-5现在正进行2期临床试验研究，即neofox研究，该研究包括ii/iii期结肠癌患者，这些患者在诊断时被认为具有原发性肿瘤被术切除后的高复发风险。复发风险的评估是根据已建立的评估标准进行的。研究的目的是证明foxy-5降低复发风险，主要是在wnt5a低表达患者中。该研究目前正在西班牙(16家)和匈牙利(12家)的28家医院进行。
5、foxy-5本身及用于其制备的经典固相(spss)方法描述于国际专利公开号wo2006/130082(a peptide ligand to impair cancer cell migration[削弱癌细胞迁移的肽配体])中。已经通过该路径生产用于临床前和早期临床研究的活性药物成分(api)。由申请人研发的用于foxy-5的溶液相路径披露于国际专利公开号wo 2020/038878(solution phaseroutes for wnt hexapeptides[用于wnt六肽的溶液相路径])和wo 2020/120198(linearsolutionphase synthesis for wnt hexapeptides[用于wnt六肽的线性溶液相合成])中。
6、由于无盐原料药(ds)在水中有限的溶解度，目前foxy-5的制造工艺应用的用于最终冻干的产品浓度仅为3g/l。这呈现为严重限制foxy-5的商业制造的生产产量的瓶颈。
7、克服该问题的最初尝试的结果是使用30％乙腈水溶液(而不是纯水)作为溶剂的替代性冻干工艺的开发。已在小规模实验中证明并在35g规模上验证，所开发的工艺适用于最高达7g/l的ds浓度的情况，即，生产率增加了＞100％。虽然该成就令人印象深刻，但当最后步骤需要如此高的稀释度时，以商业规模生产foxy-5仍然存在问题。
8、因此，提出了通过除溶剂极性调整以外的其他增溶技术来增加批量大小。从药品(dp)配制剂研究得知，从foxy-5的无盐形式到钠盐的变化将使ds溶解度增加到至少20g/l的水平。
9、应注意，在该上下文中，foxy-5含有三个羧酸部分并且没有游离氨基，因为末端氨基被甲酰化(图1)。因此，只能用碱性(basic/alkaline)化合物来制备foxy-5的盐。应注意，一些精细化学品供应商供应以“foxy-5的三氟乙酸盐”出售的化合物，其实际上仅是含有游离三氟乙酸的冻干物。
10、申请人研究了foxy-5至其钠盐的转化。由于foxy-5含有三个羧基(asp2、glu5和c末端羧酸)，因此通过用1当量、2当量和3当量的氢氧化钠处理foxy-5(25g/l)的水性浆料生成单钠盐、二钠盐和三钠盐。作为起始材料，使用含有极低量的两种已知杂质，即天冬酰亚胺(<0.1％)和二聚体(<0.1％)的foxy-5游离酸批料(结构，参见图2)。
11、foxy-5的单钠盐不能完全溶解，并且在naoh添加(1当量，ph＝3.84)后不久，观察到凝胶形成。
12、二钠盐可以在添加naoh(2当量，ph＝4.57)之后的10分钟内完全溶解。溶液的hplc分析示出了增加的天冬酰亚胺杂质的含量，而二聚体形成仅在可忽略的水平上检测到。冻干后，检测到0.07％二聚体和0.79％的天冬酰亚胺。
13、添加naoh(3当量，ph＝6.76)之后，三钠盐在5分钟内溶解，天冬酰亚胺杂质的增加极少，但观察到二聚体的形成增加。冻干后，检测到0.41％二聚体和0.17％的天冬酰亚胺。
14、在该三种盐中，发现三钠盐具有最高溶解度，>100gr/ltr，且因此最初似乎是有前景的新的候选原料药。
15、然而，在40℃下进行稳定性测试时，通过质谱发现foxy-5的三钠盐迅速产生大量的上述杂质(图3)，在40℃下4周后达到15％-20％之间的水平。
16、对foxy-5的水溶液在不同ph值下的进一步研究揭示，在ph 9下，天冬酰亚胺的含量在完全溶解后直接显著下降。将foxy-5溶液在ph 9下搅拌2小时后(参见图4)，hplc色谱图中的天冬酰亚胺峰完全消失(<lod)。已知，天冬酰亚胺在高ph值条件下发生开环，导致形成母体化合物以及β-asp和d-asp衍生物。然而，观察到显著的二聚体形成(在ph＝9下2小时后2.5％)。色谱图中二聚体的识别通过与单独合成的参考材料共同洗脱来证实。除了两种已知杂质(天冬酰亚胺和二聚体)外，三钠盐中的第三种杂质出人意料地被识别为foxy-5的脱硫cys→ala类似物(参见图2和3)，尽管量较低。
17、总之，虽然在水中的溶解度可以通过将foxy-5转化为三钠盐来增加，但该化合物太不稳定，不能作为原料药。因此，出于进一步临床试验供应以及未来的商业目的，仍需要具有令人满意的溶解度和稳定性的不同ds形式的foxy-5。
18、定义
19、如本文所用，术语“氮碱”应意指包含至少一个氮原子的碱性化合物。
20、如本文所用，术语“单盐(mono salt或mono-salt)”应意指包含1当量foxy-5和0.5-1.45当量氮碱的组合物，如本文所定义。
21、如本文所用，术语“二盐(d本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种固体组合物，其包含For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(SEQ_NO 1，Foxy-5)和氮碱，其中该氮碱是选自氨、氢氧化季铵、烷基化胍、氨基酸以及伯胺和仲胺的化合物，并且其中所述固体组合物可选地包含水。
2.根据权利要求1所述的固体组合物，其含有0.5-3.1摩尔当量的所述氮碱，相对于Foxy-5计算。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的固体组合物，其中，该氮碱是选自氨基酸、氨、以及伯胺和仲胺的化合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的固体组合物，其中，该氮碱选自氨、L-赖氨酸、L-组氨酸、N-甲基-D-葡糖胺、和氨丁三醇。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的固体组合物，其包含Foxy-5和1.50-2.49当量、比如1.7-2.1当量、比如1.9-2.03当量、比如1.95-2.01当量、比如2.0当量的选自氨、L-赖氨酸、L-组氨酸和氨丁三醇的氮碱。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的固体组合物，其包含Foxy-5和2.5-3.1当量、比如2.9-3.03当量、比如2.95
7.根据权利要求1所述的固体组合物，其选自Foxy-5的二铵盐、二-L-组氨酸盐、三-L-组氨酸盐、二-L-赖氨酸盐、二-N-甲基-D-葡糖胺盐、三-N-甲基-D-葡糖胺盐和二氨丁三醇盐，这些盐是无定形的并且可选地包含0-5当量之间的水，相对于Foxy-5计算。
8.根据权利要求2所述的固体组合物，其中，该氮碱是L-组氨酸。
9.根据权利要求8所述的固体组合物，其包含Foxy-5和1.50-2.49当量之间的L-组氨酸，比如1.7-2.1当量之间的L-组氨酸。
10.根据权利要求8所述的固体组合物，其包含Foxy-5和2.5-3.1当量之间的L-组氨酸。
11.一种用于生产根据前述权利要求中任一项所述的固体组合物的方法，该方法包括以下步骤：
12.根据权利要求11所述的用于生产固体组合物的方法，其中，使用水作为溶剂。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的用于生产固体组合物的方法，其中，该氮碱是逐渐添加到Foxy-5，同时保持该反应混合物的pH低于6.0。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的用于生产固体组合物的方法，其中，将来自步骤b、)的所得澄清溶液冻干。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的用于生产固体组合物的方法，其中，该所得固体组合物进一步经受热循环过程，该热循环过程包括：
16.根据权利要求15所述的用于生产固体组合物的方法，其中，有机溶剂选自乙醇、丙酮、四氢呋喃(THF)、乙腈/水(90/10)、和乙酸乙酯。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种固体组合物，其包含for-met-asp-gly-cys-glu-leu-oh(seq_no 1，foxy-5)和氮碱，其中该氮碱是选自氨、氢氧化季铵、烷基化胍、氨基酸以及伯胺和仲胺的化合物，并且其中所述固体组合物可选地包含水。
2.根据权利要求1所述的固体组合物，其含有0.5-3.1摩尔当量的所述氮碱，相对于foxy-5计算。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的固体组合物，其中，该氮碱是选自氨基酸、氨、以及伯胺和仲胺的化合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的固体组合物，其中，该氮碱选自氨、l-赖氨酸、l-组氨酸、n-甲基-d-葡糖胺、和氨丁三醇。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的固体组合物，其包含foxy-5和1.50-2.49当量、比如1.7-2.1当量、比如1.9-2.03当量、比如1.95-2.01当量、比如2.0当量的选自氨、l-赖氨酸、l-组氨酸和氨丁三醇的氮碱。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的固体组合物，其包含foxy-5和2.5-3.1当量、比如2.9-3.03当量、比如2.95-3.01当量、比如3.0当量的选自l-组氨酸和n-甲基-d-葡糖胺的氮碱。
7.根据权利要求1所述的固体组合物，其选自foxy-5的二铵盐、二-l-组氨酸盐、三-l-组氨酸盐、二-l-赖氨酸盐、二-n-甲基-d-葡糖胺...
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