【技术实现步骤摘要】
【】本专利技术涉及生物，特别涉及过表达tzap基因在构建听力损伤模型中的应用。
技术介绍
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技术介绍
1、端粒锌指相关蛋白(tzap)是一个端粒长度负性调节因子，能直接结合端粒双链5’-ttaggg-3’重复序列，通过启动端粒环化来调节端粒长度，防止异常延长的端粒累积，可以作为转录因子结合启动子区，调节mtfp1、snx15、ccdc106等一系列靶基因的表达。tzap还可通过特异性激活p53通路(arf-mdm2-p53-p21waf/cdkn1a)来抑制细胞增殖。在多个肿瘤中tzap表达与端粒反转录酶(tert)表达呈正相关，表明了tzap在肿瘤中的重要作用。因此，tzap蛋白在各种癌症中都有较普遍的相关表达及临床意义。但是，tzap在体内对耳蜗的作用还未探究。
2、目前，构动物的听力损伤模型多通过手术结合物理刺激的方法实现，即通过在模型动物的颅顶双侧皮质听区植入电极进行监测，然后通过白噪音扬声器的刺激使模型动物的听力下降，该方法操作复杂，而且针对个体的耐受不同，对物理刺激的要求可能会不一样，不一定能成功建模。在对听力损伤模型动物的研究中发现：会出现某些基因表达的异常，因此，考虑利用基因的上调、下调来构建听力损伤动物模型是可行的，而且模型构建方法将会更简单。
技术实现思路
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技术实现思路
1、鉴于研究进展，有必要提供过表达tzap基因在构建听力损伤模型中的应用，该研究能更简单、快速的构建小鼠听力损伤动物模型，为tzap基因在体内对
2、为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
3、过表达tzap基因在构建听力损伤模型中的应用，所述tzap基因的核酸序列如seqid no.1所示。
4、本专利技术还包括过表达tzap基因的载体在构建听力损伤模型中的应用，所述载体含有如权利要求1所述的核酸序列如seq id no.1所示。
5、本专利技术还包括过表达tzap基因的载体在构建听力损伤模型的方法，所述方法包括如下步骤：
6、(1)将tzap基因引入慢病毒载体中，得到重组载体：对tzap基因的完整cds区进行pcr扩增，得到tzap基因扩增产物；
7、(2)采用内切酶ecori和bamhi对质粒phblv-cmv-mcs-3flag-ef1-zsgreen-t2a-puro进行酶切，得到线性化的载体；
8、(3)将步骤(1)的tzap基因扩增产物连接到步骤(2)线性化的载体中得到重组质粒，对重组质粒验证并挑取阳性克隆、测序；
9、(4)对重组质粒进行抽提纯化后进行慢病毒包装，所述包装方法为：将携带目的基因的重组质粒与病毒包装辅助质粒pspax2载体和病毒包装辅助质粒pmd2g载体共转染293t细胞，转染后收集病毒上清液；
10、(5)对步骤(4)的病毒上清液进行验证检测，并将病毒上清液注射到小鼠中饲养后即得听力损伤动物模型。
11、进一步的，所述步骤(1)pcr扩增体系为：2×pcrbuffer 25μl、10mm dntps mix 1μl、10mm上游引物2μl、10mm下游引物2μl、200ng/ul模板dna 1μl、ddh2o 18μl、高保真dna聚合酶1μl；pcr扩增程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃～72℃退火15s，72℃延伸30～60s，27～35个循环；最后，72℃延伸10min后12℃保存。
12、进一步的，所述步骤(2)的载体酶切体系为：1ug/ul的载体dna 1μl、10×buffer 4μl、ddh2o 32μl、bamhi酶1.5μl、ecori酶1.5μl。
13、本专利技术具有如下有益效果：
14、本申请阐明了tzap基因对耳蜗的作用，利用过表达tzap基因建立听力损失动物模型，该方法相对于现有的听力损伤模型构建方法来讲更加简单，不需要手术植入电极，通过噪声物理干预并实时监测来实现听力模型的建立，只需要注射过表达tzap基因慢病毒，就可以实现小鼠听力损伤模型的构建，该基因对耳蜗的影响研究，有助于揭示tzap基因在听力损失发生发展中的重要作用，为耳聋的治疗提供潜在靶点以及提供一种新的听力损失造模方法。
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1.过表达TZAP基因在构建听力损伤模型中的应用，其特征在于，所述TZAP基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.过表达TZAP基因的载体在构建听力损伤模型中的应用，其特征在于，所述载体含有如权利要求1所述的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.过表达TZAP基因的载体在构建听力损伤模型的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
4.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)PCR扩增体系为：2×PCRBuffer 25μL、10mM dNTPs mix 1μL、10mM上游引物2μL、10mM下游引物2μL、200ng/uL模板DNA 1μL、ddH2O 18μL、高保真DNA聚合酶1μL；PCR扩增程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃～72℃退火15s，72℃延伸30～60s，27～35个循环；最后，72℃延伸10min后12℃保存。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的载体酶切体系为：1ug/uL的载体DNA 1μL、10×buffer 4μL、ddH2O 32μ
...【技术特征摘要】
1.过表达tzap基因在构建听力损伤模型中的应用，其特征在于，所述tzap基因的核酸序列如seq id no.1所示。
2.过表达tzap基因的载体在构建听力损伤模型中的应用，其特征在于，所述载体含有如权利要求1所述的核酸序列如seq id no.1所示。
3.过表达tzap基因的载体在构建听力损伤模型的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
4.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)pcr扩增体系为：2×pcrbuffer 25μl、10mm dntps mix 1...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐菲，韦金彪，彭康灵，别亚男，
申请(专利权)人：广州华腾生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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