【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及环状rna光电化学检测和生化传感体系的制备，具体涉及一种基于催化发夹组装循环反应和g四联体-血红素dna酶形成反应的生化传感体系的制备方法，该生化传感体系用于环状rna的光电化学比色检测。
技术介绍
1、环状rna(circularrna缩写为circrna)是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly(a)尾巴，并以共价键连接形成环形结构的非编码rna分子。circrna含有mirna应答元件，可充当竞争性内源rna，与mirna结合，在细胞中起到mirna海绵的作用，进而解除mirna对其靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达水平。作为具有闭合环状结构的一类特殊的非编码rna分子，circrna具备环状结构、无poly(a)尾巴和非编码rna的三个显著特征，相比于线性mirna分子，circrna的生物稳定性更高。circrna是单链共价的闭合型rna分子，在从病毒到哺乳动物的物种中无处不在。大部分的circrna由外显子环化而成，而少部分是由内含子环化而形成了套索结构。
2、circrna主要存在于细胞质中，也有一些储存于外泌体内，这种分布使circrna能在细胞质中发挥重要的生物学功能，也可通过外泌体在细胞间进行传递。circrna的序列与其同源异构体-线性rna的序列几乎重叠，由于其独特的共价闭合环状结构和反向剪接位点(back-splice junction缩写为bsj)的存在，circrna和同源异构体-线性rna在细胞内的功能和稳定性上均存在显著的差异。特别是共价闭合环状结构赋予了circrn
3、circrna具有独特的表达特征，并在各种疾病中发挥关键作用，使其能够潜在地作为诊断生物标志物和治疗靶点。circrna通过参与基因的转录与翻译调控，在细胞增殖、凋亡、衰老等多种生命活动中发挥着重要作用。同时，circrna在心血管病、肝癌、乳腺癌等疾病中的特异性表达，使其成为潜在的生物标志物。比较常见的circrna检测方法主要包括实时荧光定量pcr(qrt-pcr)法定量验证，以及印迹杂交分析(northernblotting)、测序与比对等。例如，刘敬欣等开发了一种基于微流控技术检测环状rna的方法(刘敬欣；贺世亮；温建城.国家专利技术专利申请公布号:cn117587103a)，王珊珊等设计了一种基于毛细管凝胶电泳的环状rna检测方法(王珊珊；董佳；曹金平；王番.国家专利技术专利申请公布号:cn117538404a)，朱立博等公开了一种基于纳米孔的环状rna疫苗纯度的定量快速检测方法(朱立博；谭生伟；杨海平；高兵；谭政.国家专利技术专利申请公布号:cn117517427a)，廖迅等提供了一种基于crispr-cas13a系统的可视化环状rna快速检测试剂盒及其应用(廖迅；彭勇.国家专利技术专利申请公布号:cn115948405a)。
4、尽管qrt-pcr的准确性较高且检测时间短，但是其准确性可能受到多种因素的影响，尤其是引物的设计需要非常精确才能避免扩增线性rna。印迹杂交分析对于低丰度的circrna不够敏感，且分析过程耗时较长，不利于快速检测和分析。在当前分析检测技术的背景下，亟需开发出一种能够检出低丰度，且灵敏度高和操作简单的用于circrna高效检测的生化传感体系。基于此，本专利技术开发了一种基于催化发夹组装循环反应(catalytichairpin assembly缩写为cha)和g四联体-血红素dna酶(g-quadruplex-hemin dnazyme)形成反应的生化传感体系及其制备方法，该生化传感体系用于环状rna的光电化学比色检测。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于催化发夹组装循环反应和g四联体-血红素dna酶形成反应的生化传感体系的制备方法，该生化传感体系用于针对环状rna的高选择性、高灵敏度和简单快速的光电化学比色检测。
2、为实现上述目的，本专利技术涉及的一种用于环状rna光电化学比色检测的生化传感体系，具备如下显著特征：
3、(1)利用特定的探针，通过催化发夹组装循环反应(cha)对环状rna(circrna)进行特异性识别；利用限制性核酸内切酶切割cha的产物，然后再与血红素(hemin)结合形成g四联体-血红素dna酶(g-quadruplex-hemin dnazyme)，实现信号的放大；最后通过比色方法检测，实现了对circrna的定量测定。
4、(2)连接在纳米磁珠(mnps)表面的探针本体是对circrna反向剪接位点(bsj)序列具有特异性识别功能的特定核酸探针即h1，其核酸序列为5’-cac aag cct ccc ttt tgtttt tct gaa att gagagt cagaaa aacaaa agg gcc gggagg gatggg tt-3’，探针h1采用3’-端氨基化处理后与羧基化的mnps组成探针mnps/h1；游离探针h2，其核酸序列为5’-gtttttctgact ctcaatttcagaaaaacaaaa ggg gaaattgagagtc-3’，在目标检测物circrna存在的条件下，游离探针h2与mnps/h1发生特异性识别作用，进而形成mnps/h1/h2复合体系。
5、(3)探针mnps/h1的制备：mnps与偶联剂1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)混合，完成mnps表面羧基的活化后与h1混合，过夜孵育，制备得到探针mnps/h1。
6、(4)cha的反应条件：按1:1:1:1的体积比依次量取探针mnps/h1、目标检测物circrna、h2分散液和磷酸盐缓冲液(pbs)缓冲液，均匀混合后在37℃下反应，通过磁分离处理混合体系得到cha反应产物；该产物具备如下特征，即探针mnps/h1与circrna的bsj序列通过碱基互补配对结合后形成mnps/h1/bsj复合物，探针h1的发夹结构因此被打开，探针h2与探针h1的识别位点暴露，二者相互结合，进而释放出circrna，形成cha反应产物与mnps/h1/h2的复合物。
7、(5)g-quadruplex-hemin dnazym的形成反应：在限制性核酸内切酶的作用下，mnps/h1/h2复合物中的探针h1和h2的部分序列被释放出来，而探针h1靠近3’端的序列依然保留在mnps上，随后与hemin溶液结合，形成具有类过氧化物酶活性的g-quadruplex-hemindnazyme结构。
8、(6)circrna的测定：将表面结合了一定量g-quadruplex-hemin dnazyme的mnps与3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)和过氧化氢(h2o2)混合，加入目标检测物circrna后进行反应；基于所形本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于环状RNA光电化学比色检测的生化传感体系，具备如下显著特征：
【技术特征摘要】
1.一种用于环状rna光电化学比色检...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐庆国，李春涵，戴德淑，曹喜玥，夏建飞，李欣蔚，徐显朕，
申请(专利权)人：青岛大学附属医院，
类型：发明
国别省市：
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