【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物，涉及免疫层析检测，具体是涉及一种猴痘病毒检测的引物探针组合及其应用。
技术介绍
1、猴痘病毒(monkeypox virus，mpxv)是一种包膜双链dna病毒，与天花病毒(variola virus，varv)同属于痘病毒科，正痘病毒属。感染的症状与天花相似，俗称“猴天花”。猴痘可从动物传染给人类，病例通常发生在热带雨林附近。虽然mpxv在人与人之间的传播有限，但它可以通过直接接触猴痘患者皮肤或病变粘膜而感染。历史上，猴痘的潜伏期为5至21天。通常，临床疾病的前体期持续1-5天，在此期间患者可能出现发烧、头痛、背痛、肌肉疼痛和淋巴结病。第二阶段通常发生在发烧消退后，其特征是皮疹，可能涉及口腔粘膜、结膜、角膜和/或生殖器。
2、对于mpxv测试确认，最佳诊断标本取自皮肤(黏膜)病变部位，包括病变表面拭子、痘疱渗出物拭子、痘痂拭子等。随着分子生物学技术的发展，基于基因靶点的快速扩增已成为实验室常用的方法。目前，采用定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chainreaction，qpcr)检测病毒dna是首选的猴痘实验室检测方法。然而，它需要精密的温控仪器和训练有素的工作人员，限制了其在资源有限情况下的广泛应用。
3、在了解核酸扩增原理的基础上，等温核酸扩增逐渐成为一种备选方案，结合对免疫层析技术的认识，研究人员越来越重视开发即时检测技术，而等温扩增试纸条技术，以其灵敏度高、成本低、速度快、无需仪器及现场出结果等特点，在资源贫乏的实验室和户外检测中显示出更
4、鉴于此，建立简单、快速、高灵敏度的猴痘病毒快速检测方法，开发适用于目前临床使用和科研用的猴痘快速检测产品是非常有必要的。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术的目的是提供猴痘病毒检测的引物探针组合、以及其在检测猴痘病毒的反应液、试剂盒中的应用，所述引物探针组合和相应反应液能实现快速、高灵敏和特性性地检测猴痘病毒。
2、实现上述目的技术方案包括如下。
3、本专利技术的第一方面，是提供一种猴痘病毒检测的引物探针组合，所述猴痘病毒检测的引物探针组合包括：上游引物、下游引物和探针；所述上游引物为：序列如seq id no:4所示的mpv3-f3l-f1，所述下游引物为：序列如seq id no:11所示的mpv3-f3l-nr2，所述探针为序列如seq id no:14所示的mpv-f3l-np3。
4、本专利技术的第二方面，是提供上述引物探针组合在制备猴痘病毒恒温检测试剂盒中的应用。
5、本专利技术的第三方面，是提供一种猴痘病毒检测试剂盒，其包括任一上述引物探针组合。
6、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括干粉反应管，所述反应管内含有由反应液制备而成的冻干粉，所述反应液包括重组酶520-725ng/μl；单链dna结合蛋白100-200ng/μl；dna聚合酶350-450ng/μl；核酸内切酶300-400ng/μl。
7、在其中一些实施例中，所述冻干粉的制备方法包括以下步骤：将所述反应液在-80℃条件下预冻1～1.5小时得到预冻试剂，将预冻试剂先置于-35～-45°c环境下干燥2～10小时，再置于10～18℃环境下干燥1～2小时，得到冻干粉。
8、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括abuffer、bbuffer和ddh2o；所述abuffer包括：15mm～25mm tris-hcl，130mm～170mm kcl，4v/v％～6v/v％peg，0.5v/v％～1.5v/v％triton-x100，所述abuffer的ph为8.0～9.0，所述bbuffer包括：180mm～220mm醋酸镁。
9、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括检测试纸条，所述试纸条由pvc背板以及依次设置于pvc背板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸制备而成，对照线和检测线分别包被bsa-biotin和抗荧光素抗体。
10、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括反应仓，反应仓内包括恒温模块、上述检测试纸条。
11、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括双气囊滴管，可作为移液枪的替代品。
12、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括稀释液，成分为ddh2o。
13、在其中一些实施例中，上述试剂盒还包括：abuffer、b buffer和ddh2o；所述abuffer包括：15mm～25mm tris-hcl，130mm～170mm kcl，4v/v％～6v/v％peg，0.5v/v％～1.5v/v％triton-x100，abuffer的ph为8.0～9.0。
14、所述b buffer包括：180mm～220mm醋酸镁。
15、本专利技术的第四方面，是提供一种猴痘病毒检测的反应体系，其包括：abuffer、bbuffer、引物探针组合和ddh2o，
16、所述引物探针组合包括：上游引物、下游引物和探针，所述上游引物为：序列如seqid no:4所示的mpv3-f3l-f1，所述下游引物为：序列如seq id no:11所示的mpv3-f3l-nr2，所述探针为：序列如seq id no:14所示的mpv-f3l-np3。
17、在其中一些实施例中，在反应体系中，上述上游引物的浓度为10μm，上述下游引物的浓度为10μm，上述探针的浓度为10μm。
18、在其中一些实施例中，所述反应体系中的镁离子的浓度为200mm。
19、本专利技术的第五方面，是提供上述任一项试剂盒或上述任一项反应体系用于非诊断目的的检测猴痘病毒核酸的检测方法。
20、一种非疾病诊断目的的猴痘病毒核酸的检测方法，包括以下步骤：
21、s1、提取待测样本中的核酸；
22、s2、将核酸加入含有abuffer、引物探针组合、ddh2o、b buffer的反应体系，充分混匀，放入恒温设备中39℃～42℃孵育20min；
23、s3、加入ddh2o，混匀后，用猴痘病毒核酸的胶体金检测试纸检测并观察结果；
24、所述步骤s2中的引物探针组合包括：上游引物、下游引物和探针，所述上游引物为：序列如seq id no:4所示的mpv3-f3l-f1，所述下游引物为：序列如seq id no:11所示的mpv3-f3l-nr2，所述探针为：序列如seq id no:14所示的mpv-f3l-np3。
25、在其中一些实施例中，所述待测样本选自咽拭子、皮疹渗出物拭子、痘疱液、痘疱表皮、痘痂、全血、血清等体液中的至少一种。
26、本专利技术通过专利技术人对猴痘病毒的大量研究，基于f3l基因进行了引物和探针的探索和设计，筛选得到引物探针组合具有更高的检测灵敏度，所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猴痘病毒检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括：上游引物、下游引物和探针，其序列组成分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14所示。
2.权利要求1所述的引物探针组合在制备猴痘病毒恒温检测试剂盒中的应用。
3.一种猴痘病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测试纸条，所述试纸条由PVC背板以及依次设置于PVC背板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸制备而成，对照线和检测线分别包被了BSA-biotin和抗荧光素抗体。
5.根据权利要求3-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括Abuffer、B buffer和ddH2O；所述Abuffer包括：15mM～25mM Tris-HCl，130mM～170mM KCl，4v/v％～6v/v％PEG，0.5v/v％～1.5v/v％TRITON-X100，所述Abuffer的pH为8.0～9.0，所述
6.根据权利要求3-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括干粉反应管，所述干粉反应管内含有冻干粉，所述冻干粉由包括重组酶520-725ng/μL；单链DNA结合蛋白100-200ng/μL；DNA聚合酶350-450ng/μL；逆转录酶400-500ng/μL；核酸内切酶300-400ng/μL的溶液冻干而成。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述冻干粉的制备方法包括以下步骤：将所述反应液在-80℃条件下预冻1～1.5小时得到预冻试剂，将预冻试剂先置于-35～-45℃环境下干燥2～10小时，再置于10～18℃环境下干燥1～2小时，得到冻干粉。
8.一种猴痘病毒检测的反应体系，其特征在于，所述反应液体系中有：Abuffer、Bbuffer、上游引物、下游引物、探针和ddH2O，所述上游引物为：序列如SEQ ID NO:4所示的MPV3-F3L-F1，所述下游引物为：序列如SEQ ID NO:11所示的MPV3-F3L-nR2，所述探针为：序列如SEQ ID NO:14所示的MPV-F3L-nP3，所述引物和探针的在反应中的浓度为：10μM，所述反应体系中的镁离子的浓度为200mM。
9.一种非疾病诊断目的的猴痘病毒核酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述疾病诊断目的的猴痘病毒核酸的检测方法，其特征在于，所述待测样本来自咽拭子、皮疹渗出物拭子、痘疱液、痘疱表皮、痘痂、全血、血清中的至少一种。
...【技术特征摘要】
1.一种猴痘病毒检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括：上游引物、下游引物和探针，其序列组成分别如seq id no:4、seq id no:11和seq id no:14所示。
2.权利要求1所述的引物探针组合在制备猴痘病毒恒温检测试剂盒中的应用。
3.一种猴痘病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测试纸条，所述试纸条由pvc背板以及依次设置于pvc背板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸制备而成，对照线和检测线分别包被了bsa-biotin和抗荧光素抗体。
5.根据权利要求3-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括abuffer、b buffer和ddh2o；所述abuffer包括：15mm～25mm tris-hcl，130mm～170mm kcl，4v/v％～6v/v％peg，0.5v/v％～1.5v/v％triton-x100，所述abuffer的ph为8.0～9.0，所述b buffer包括：180mm～220mm醋酸镁。
6.根据权利要求3-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括干粉反应管，所述干粉反应管内含有冻干粉，所述冻干粉由包括重...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾红玲，顾兵，狄飚，秦鹏哲，王文波，周丽娟，张德才，郑帅，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：
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