【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于单克隆抗体，具体涉及抗her2单克隆抗体及其基因以及制备方法和应用。
技术介绍
1、her2（人类表皮生长因子受体2，human epidermal growth factor receptor 2，缩写为her2，亦称为neu、erbb-2、cd340或p185）是一种由erbb2原癌基因编码的酪氨酸激酶受体膜糖蛋白，her2是表皮生长因子受体（egfr/erbb）家族的成员。已知在人类多种肿瘤中，包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等，都发现有her2原癌基因扩增或者蛋白过表达现象，临床上称为her2阳性肿瘤。her2蛋白的过表达导致her2同源及异源二聚体形成增多，从而通过激活mapk和p13k等信号通路引起细胞增殖、抗凋亡、侵袭及血管生成等效应。her2阳性肿瘤临床表现为恶性程度高，浸润和转移能力性强，对常规化疗药物不敏感，且治疗预后差。
2、研究表明靶向her2的单克隆抗体药物可通过直接及间接机制发挥抗肿瘤作用。曲妥珠单抗（trastuzumab）是全球首个针对her2的人源化单抗，于1998年由fda获批上市。曲妥珠单抗在乳腺癌的辅助治疗、新辅助治疗和转移性治疗方面已成为her2阳性乳腺癌患者的标准方案。曲妥珠单抗极大地改善了her2阳性乳腺癌患者的预后。然而，大约50-60%的her2阳性乳腺癌患者会对抗体产生耐药性，从而使其无效。
3、虽然，存在一些上市的靶向her2的单克隆抗体药物，但是，在治疗一段时间后可能会产生耐药性，影响药物的治疗效果。如果能够开发出多种类型的靶向
技术实现思路
1、本专利技术意在提供抗her2单克隆抗体，以解决现有技术中的缺少识别不同her2抗原表位的抗体导致的肿瘤耐药问题难以克服的技术问题。
2、为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体，其重链的互补决定区1、互补决定区2和互补决定区3的氨基酸序列分别为ggsitnyy、yyggn、carhggtygfdsw；其轻链的互补决定区1、互补决定区2和互补决定区3的氨基酸序列分别为rasqgisnyla、aasslqs、cqqynsypltf。
4、进一步，其重链的氨基酸序列如seq id no.1所示、核苷酸序列如seq id no.9所示；其轻链的氨基酸序列如seq id no.10所示、核苷酸序列如seq id no.18所示。
5、本技术方案还提供了抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体在制备治疗细胞表面表达人类表皮生长因子受体2蛋白的癌症的药物中的应用。本方案获得的单克隆抗体可以用于抑制表达her2的癌症细胞的生长，例如实施例4：抗her2人源化抗体eb-001的表达、纯化及功能验证中的实验验证了上述效果。
6、进一步，所述癌症包括乳腺癌、宫颈癌。本技术方案还提供了抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体在制备检测癌细胞表达人类表皮生长因子受体2蛋白的癌症的试剂中的应用。本方案获得的单克隆抗体可以特异性结合her2，因此，可以用于检测表达her2的癌症细胞，例如实施例4：抗her2人源化抗体eb-001的表达、纯化及功能验证中的实验验证了上述效果。本技术方案还提供了抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体在制备嵌合抗原受体t细胞中的应用。在现有技术的嵌合抗原受体car的序列的基础上加入了本方案获取的eb-001抗体的重链可变区和轻链可变区，使构建的car-t细胞具有了靶向her2的能力。
7、进一步，嵌合抗原受体t细胞的嵌合抗原受体的核苷酸序列如seq id no. 19所示。本技术方案还提供了一种嵌合抗原受体蛋白，其核苷酸序列如seq id no. 19所示。本方案的嵌合抗原受体蛋白为一种新型的融合蛋白，通过现有技术常规手段，在t细胞中表达这种新的融合蛋白，可以实现针对表面表达her2蛋白的car-t疗法。本技术方案还提供了一种嵌合抗原受体t细胞，其表达有核苷酸序列如seq id no. 19所示的嵌合抗原受体；其由如下方法制备：将如seq id no. 19所示的嵌合抗原受体基因整合到载体上，形成表达质粒；包装表达质粒形成慢病毒；慢病毒感染t细胞，获得嵌合抗原受体t细胞。
8、本技术方案还提供了抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体的制备方法，将如seqid no.9所示的表达抗体重链的基因整合到载体上，形成重链表达质粒；将如seq id no.18所示的表达抗体轻链的基因整合到载体上，形成轻链表达质粒；将重链表达质粒和轻链表达质粒共同转染细胞，再经细胞培养后获得抗体。
9、综上所述，本技术方案的原理以及有益效果在于：
10、本技术方案首先构建了稳定超表达her2蛋白（抗原）的鼠源细胞系（kqlb-84-her2细胞系）。然后使用kqlb-84-her2细胞系免疫小鼠，通过杂交瘤融合及阳性克隆筛选，获得杂交瘤细胞株m-eb-001，该细胞株可以产生与her2蛋白具有较强结合力的抗体。对抗her2杂交瘤细胞克隆m-eb-001进行序列分析，进一步获得序列信息，并进行了抗体的人源化处理。在此基础上，可以进行抗体的人工合成或者表达，形成可商业化的抗her2蛋白的抗体。除此之外，本技术方案获得的重链和轻链序列还可以用于制备car-t细胞的嵌合抗原受体，实现针对表面表达her2抗原的癌细胞的杀灭。不同于现有技术惯常的使用抗原蛋白（或者蛋白片段）进行动物免疫的手段，本技术方案使用了表达抗原蛋白的细胞进行动物免疫，可以获得有别于现有技术的新型抗体，进一步解决现有技术中的缺少识别不同her2抗原表位的抗体导致的肿瘤耐药问题难以克服的技术问题。本技术方案获得的抗体（特别是互补决定区）序列不同于现有技术任何的抗her2抗体，同现有的曲妥珠单抗等具有相似的作用效果，可以作为治疗同类癌症的抗体并同时克服单一药物带来的肿瘤耐药性的问题。
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1.抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体，其特征在于，
2. 根据权利要求1所述的抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体，其特征在于，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示、核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体在制备治疗细胞表面表达人类表皮生长因子受体2蛋白的癌症的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体在制备治疗癌细胞表达人类表皮生长因子受体2蛋白的癌症的药物中的应用，其特征在于，所述癌症包括乳腺癌、宫颈癌。
5.根据权利要求1或2所述的抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体在制备检测癌细胞表达人类表皮生长因子受体2蛋白的癌症的试剂中的应用。
6.根据权利要求1或2所述的抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体在制备嵌合抗原受体T细胞中的应用。
7. 根据权利要求1或2所述的抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体在制备嵌合抗原受
8. 一种嵌合抗原受体蛋白，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
9. 嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，其表达有核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的嵌合抗原受体；
10. 根据权利要求2所述的抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，将如SEQ ID NO.9所示的表达抗体重链的基因整合到载体上，形成重链表达质粒；
...【技术特征摘要】
1.抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体，其特征在于，
2. 根据权利要求1所述的抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体，其特征在于，其重链的氨基酸序列如seq id no.1所示、核苷酸序列如seq id no.9所示；其轻链的氨基酸序列如seq id no.10所示、核苷酸序列如seq id no.18所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体在制备治疗细胞表面表达人类表皮生长因子受体2蛋白的癌症的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体在制备治疗癌细胞表达人类表皮生长因子受体2蛋白的癌症的药物中的应用，其特征在于，所述癌症包括乳腺癌、宫颈癌。
5.根据权利要求1或2所述的抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体在制备检测癌细胞表达人类表...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑利，何巍，胡以国，潘聪，邱焕迪，
申请(专利权)人：成都以邦医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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