【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种在枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)建立的crispr/cas9组件的高表达系统。
技术介绍
1、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)作为革兰氏阳性细菌的模式微生物与食品安全菌株，在基础科学以及工业发酵中均具有广泛应用。近年来，合成生物学与代谢工程等学科领域的发展为其提供了大量的基因操作和表达调控的工具，包括基于crispr-cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and crispr-associated protein,成簇的规律间隔短回文重复序列及crispr相关蛋白)的各类系统。
2、枯草芽孢杆菌核糖体rna(ribosome rna，rrna)启动子具有高表达的特性。将其设置于所述目的基因原有启动子的位置，目的基因为sgrna系非核糖体rna基因，将连接有核糖体rna启动子的目的基因导入枯草芽孢杆菌，以实现所述目的基因在枯草芽孢杆菌的高表达。该方法实现了目的基因在枯草芽孢杆菌的强启动和显著的稳定高表达，且不会随着受体细胞的传代而发生重组或丢失。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于在枯草芽孢杆菌中建立一套crispr/cas9组件的高效表达系统。本专利技术借助核糖体rrna启动子高表达的特性，构建含有rrna启动子、sgrna片段、cas9片段的整合质粒，将整合质粒转化至枯草芽孢杆菌中，以达到crispr系统在枯草芽孢
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案，所述的具体操作步骤为：
3、(1)高表达启动子p1的获取及重组菌的构建，构建含有rrna启动子(p1启动子)、sgrna片段、cas9片段的整合质粒。
4、(2)利用枯草芽孢杆菌sck6和pdgief载体都携带有amye基因这一共同点，将重组载体pdgief目的片段精确地整合到枯草芽孢杆菌sck6的感受态细胞中。
5、(3)对枯草芽孢杆菌核糖体rna为启动子所构建的可表达crispr/cas9系统组件的sck6重组菌进行了表达量检测，证明了枯草芽孢杆菌核糖体rna启动子比hpa ii强启动子更高表达。
6、与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
7、本研究新构建的菌株中，sgrna和cas9 mrna的表达量均显著高于对照菌株。这一结果证明了在枯草芽孢杆菌中，rrna启动子能够促使crispr/cas9组件实现更高的表达水平。
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1.一种在枯草芽孢杆菌中建立的CRISPR/Cas9组件高表达系统的方法，其特征在于，利用枯草芽孢杆菌表达系统的优点和rRNA启动子高表达的特性，实现了CRISPR/Cas9组件在枯草芽孢杆菌中的高表达；所述rRNA启动子序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体操作方法为：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Cas9片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.一种枯草芽孢杆菌中CRISPR/Cas9组件的高表达系统，其特征在于，利用权利要求1-3任一所述方法构建得到。
【技术特征摘要】
1.一种在枯草芽孢杆菌中建立的crispr/cas9组件高表达系统的方法，其特征在于，利用枯草芽孢杆菌表达系统的优点和rrna启动子高表达的特性，实现了crispr/cas9组件在枯草芽孢杆菌中的高表达；所述rrna启动子序列如seq id no.1所示。
2.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：张子平，王艺磊，张文欣，靳雅琦，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：
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