【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及类器官培养，尤其涉及一种鹅肾脏类器官及其培养方法、应用。
技术介绍
1、新型鹅星状病毒（goose astrovirus，gastv）是近年来新发现的一种致雏鹅痛风且高度致死的禽星状病毒，感染主要造成雏鹅内脏器官表面和关节腔内产生大量的尿酸盐沉积，与痛风等代谢疾病息息相关的肾脏是gastv的主要靶器官之一。阐明gastv导致雏鹅痛风的致病机理显得尤为重要，以为该病的科学防控提供理论参考。然而，目前尚无理想的鹅肾细胞系，且缺乏能模拟体内肾脏组织高度复杂的结构和功能的体外研究模型，导致gastv感染与宿主相互作用的研究受到了极大的限制。
2、lmh细胞系作为目前最常用于gastv体外研究的细胞平台，其来源于鸡，与gastv宿主的物种并不相同，且gastv无法在lmh细胞中充分高效复制，因此更加无法模拟gastv感染鹅后产生的相关免疫和代谢应答反应。
3、鹅胚原代肾细胞（gek）虽然能够高效增殖gastv，但要想获得纯度较高的gek细胞难度往往较大。在制备好的原代细胞中，随着培养时间的延长，纤维细胞往往会成为优势生长细胞并逐渐抑制肾细胞，降低了后续研究的可行性及数据的真实性。且原代细胞需现做现用，缺乏便利性。更重要的是，体外细胞模型结构简单、细胞类型单一，完全无法模拟体内组织器官的三维结构和生理功能，对于机体的代谢应答更加难以做出应有的反应。
4、动物感染模型，可以在完整的动物中或立体研究中进行机械评估，虽能完美地反映出该机体的各种应答反应，但动物模型价格昂贵、劳动强度大，无法用于高通
5、基于此，需要一种更好地用于研究gastv致病机制的感染模型，尤其是肾脏模型，即鹅肾脏类器官。类器官是一种3d细胞培养系统，与体内来源的组织或器官高度相似，可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用。理想状态下，类器官与体内分化组织具有相似的生理反应。因此，建立一种能模拟鹅肾脏复杂生理特性的体外肾脏类器官模型，对于gastv致病机制、抗病毒筛选及其他研究具有重要意义。
6、现有技术1：中国专利申请202211653818.4公开了一种诱导干细胞分化的组合物、培养基及其应用和制备禽类肠道类器官的方法，含有该方案提供的组合物的培养基特别适合禽类肠道类器官的制备，而且可以在类器官诱导培养和传代过程（即类器官原代培养和传代培养）中通用，简化了肠道类器官构建的材料选择，降低了实验失误的可能性。该方案提供的方法具有较高的禽类肠道类器官构建成功率，并且还有流程简单、快速、高效的优点，有效提高实验效率，适合推广应用；
7、进一步观察该方案可见，该方案中，l-谷氨酰胺补充剂的终浓度为1～3mm，wnt蛋白的终浓度为5～500ng/ml，牛血清蛋白的终浓度为0.5～2重量％，烟酰胺的终浓度为5～15mm，地塞米松的终浓度为5～20μ，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的终浓度为5～15mm，n2添加剂的终浓度为1×～2×，b27添加剂的终浓度为1×～2×，n-乙酰半胱氨酸的终浓度为0.5-1.5mm，r-脊椎蛋白的终浓度为100～1000ng/ml，表皮生长因子的终浓度为10～200ng/ml，头蛋白的终浓度为50～200ng/ml，gastrin i的终浓度为5～20nm，a83-01的终浓度为0.5～1μm，sb202190的终浓度为5～15μm，y27632的终浓度为5～15μm；
8、进一步观察该方案的说明书第97段可见，该方案并未公开其原代组织的来源，并且，观察该方案的说明书第86段可见，该方案的培养基中并不包含待培养物的血清成分。
9、现有技术2：中国专利申请202110164788.x公开了一种细胞培养液及其在鸡小肠类器官培养中的应用。所述的细胞培养液以advanced dmem/f12为基础培养基，并添加特定量的鸡血清、a83-01、sb202190、chir99021和丙戊酸。通过在鸡小肠类器官培养中使用所述细胞培养液，可以大幅度提高鸡小肠类器官的平板率及鸡小肠类器官的生存时间，同时该方法获得的类器官可以表达各种肠上皮细胞（包括肠细胞，杯状细胞，肠内分泌细胞等）的标志基因；
10、进一步观察该方案中基础培养基的组成可见，包括1%的青链霉素混合液；1%的glutamax；2%的b27；1%的n2；0.25%的鸡血清；
11、以及如下浓度的组分：10mm的hepes；1μm的n-乙酰半胱氨酸；50ng/ml的重组鼠表皮生长因子；100ng/ml的重组鼠noggin；500ng/ml的重组鼠r-spondin1；10μm的y-27632；500nm的a83-01；10μm的sb202190；3μm的chir99021；1mm的丙戊酸。
12、可见，该方案公开了鸡血清在鸡的类器官培养中的应用，但其在培养基中的添加量仅为培养基的0.25%。
13、本方案需要解决的问题：如何提供一种鹅肾脏类器官的培养方法。
技术实现思路
1、本申请的目的是提供一种鹅肾脏类器官的培养方法，该培养方位通过3d细胞培养系统，与体内来源的组织或器官高度相似，可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用。
2、为实现上述目的，本方案提供了一种鹅肾脏类器官的培养方法，包括以下步骤：
3、步骤1：取鹅胚，分离原代肾脏组织，一次清洗、破碎、消化、过滤、二次清洗，得到原代细胞；
4、步骤2：将原代细胞与基质胶混合、凝固，得到胶体混合物，随后置于含有鹅血清的培养液中培养至少10天，得到鹅肾脏类器官；
5、其中，按每0.9×104～1.1×104个原代细胞与70 μl的基质胶混合、凝固，得到胶体混合物。
6、优选地，所述步骤1中，鹅胚为至少达到25日龄的鹅胚。
7、优选地，所述步骤1中，鹅胚为至少达到28日龄的鹅胚。
8、优选地，所述含有鹅血清的培养液中，鹅血清的质量分数为2～15%。
9、优选地，所述含有鹅血清的培养液中，鹅血清的质量分数为6～15%。
10、优选地，所述含有鹅血清的培养液中，鹅血清的质量分数为10%。
11、此外，本申请还公开了一种鹅肾脏类器官，通过上述的鹅肾脏类器官的培养方法制得。
12、此外，本申请还公开了鹅肾脏类器官作为体外肾脏类器官模型的用途。
13、本申请的有益效果是：
14、使用本申请培养得到的鹅肾脏类器官为3d细胞培养系统，与体内来源的组织或器官高度相似，可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，并且，本申请在试验过程中惊喜地发现，通过对原代细胞的来源以及培养基中组分的控制能够进一步缩短类本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鹅肾脏类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的鹅肾脏类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤1中，鹅胚为至少达到25日龄的鹅胚。
3.根据权利要求1所述的鹅肾脏类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤1中，鹅胚为至少达到28日龄的鹅胚。
4.根据权利要求1所述的鹅肾脏类器官的培养方法，其特征在于，所述含有鹅血清的培养液中，鹅血清的质量分数为2～15%。
5.根据权利要求1所述的鹅肾脏类器官的培养方法，其特征在于，所述含有鹅血清的培养液中，鹅血清的质量分数为6～15%。
6.根据权利要求1所述的鹅肾脏类器官的培养方法，其特征在于，所述含有鹅血清的培养液中，鹅血清的质量分数为10%。
7.一种鹅肾脏类器官，其特征在于，通过权利要求1-6中任一所述的鹅肾脏类器官的培养方法制得。
8.如权利要求7所述的鹅肾脏类器官作为体外肾脏类器官模型的用途。
【技术特征摘要】
1.一种鹅肾脏类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的鹅肾脏类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤1中，鹅胚为至少达到25日龄的鹅胚。
3.根据权利要求1所述的鹅肾脏类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤1中，鹅胚为至少达到28日龄的鹅胚。
4.根据权利要求1所述的鹅肾脏类器官的培养方法，其特征在于，所述含有鹅血清的培养液中，鹅血清的质量分数为2～15%。
...【专利技术属性】
技术研发人员：向勇，孙敏华，廖明，李林林，董嘉文，张俊勤，黄允真，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：
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