【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药和生物化工，具体涉及一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法。
技术介绍
1、胞磷胆碱钠(citicoline or cdp-choline)是细胞膜磷脂质中的主要成分，作为内源性合成磷脂酰胆碱的中间体可促进神经细胞膜磷脂的合成。其作为脑代谢激活剂，具有修复脑损伤，抗缺氧，改善记忆，增强智力等作用。临床上主要用于急性颅脑外伤和脑手术后意识障碍；治疗帕金森氏综合症；神经性耳聋；对老年痴呆症、抑郁症、延缓衰老，提高学习效果和记忆力等有一定疗效。
2、目前，生产胞磷胆碱钠的方法主要有三种，包括化学合成法、微生物转化法和酶催化合成法。化学合成法存在反应转化率低、副产物较多、生产成本高、环境污染严重且安全隐患多等问题。
3、例如，中国专利文献cn201410250694.4a公开的制备方法，以胞苷酸、磷酸胆碱为底物，对甲苯磺酰氯为缩合剂，在n-二甲基甲酰胺存在下缩合成胞磷胆碱钠。其工艺路线如下：
4、
5、此方法的缺陷在于，胞磷胆碱钠与缩合剂分离较难，产品不适合药用。
6、中国专利文献cn102016000492243a中公开的制备方法，以氯化磷酸胆碱钙盐为原料，通过与苯进行二元共沸除去氯化磷酸胆碱钙盐中的结晶水，再与碳酸钠反应生成碳酸钙沉淀，过滤后的固体粘稠物与乙酰氯反应，产物再与胞苷酸反应得到胞磷胆碱钠。
7、此方法虽一定程度上解决了胞磷胆碱钠和缩合剂分离难的问题，但其缺陷在于，步骤复杂，合成过程中带来大量的环境污染。
8、中
9、
10、此方法的缺陷在于，原料二氯磷酰吗啉市场量较小，采购困难且价格较高，不利于工业化生产。
11、微生物转化法的原理为利用微生物细胞体内的酶系，在微生物细胞中将原料胞苷酸与磷酸胆碱进行多步酶催化反应进而得到目标产物胞磷胆碱钠。微生物转化法存在产物浓度低、杂质多、产率不高等问题。
12、中国专利cn201110232740.4b中公开的制备方法，以磷酸胆碱、5’-胞苷酸为底物，以葡萄糖作为能量供体，通过无机盐提高atp再生速率，利用东方伊萨酵母(i.orientalis)透性细胞制备胞磷胆碱钠。其工艺路线如下：
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14、此专利方法虽可利用酵母体内的酶系，以及酵母体内atp进行胞磷胆碱钠的生成，但转化率不高，产物浓度较低；由于反应液中含有大量的葡萄糖和各种无机盐，给后续的分离纯化带来较大困难。中国专利文献cn201310358526.2b中通过化学诱变选育高活力cmp激酶和高活力磷酸胆碱胞苷酰转移酶的酿酒酵母菌株，以求提高胞磷胆碱钠的转化率，虽转化率有提升，但上述问题依然存在。
15、中国专利文献cn201110052603.2a中公开的制备方法，通过将来源于酵母的磷酸胆碱转胞苷酰酶(ctt)、及e.coli中的乳清苷酸焦磷酸化酶(pyre)、乳清苷酸脱羧酶(pyrf)、尿苷酸激酶(pyrh)、核苷二磷酸激酶(ndk)和胞苷三磷酸连接酶(pyrg)整合至e.coli工程菌中获得重组菌k1-e/pugg-cct，利用重组菌在含有葡萄糖、乳清酸、磷酸胆碱、多种无机盐及有机溶剂的液体中进行生物转化获得胞磷胆碱钠。
16、此专利方法改用成本较便宜的乳清酸替代传统的5’-胞苷酸做底物，一定程度上降低了成本，但由于乳清酸至胞磷胆碱的生物路线过于繁长，所需酶系过于繁多，各个酶在重组菌中的表达情况不一，致使反应控制较困难，从而影响转化率及产率。此方法想法较好，但离生产放大还有很长一段距离。
17、酶催化合成法最早期是利用磷酸胆碱转胞苷酰酶(ctt)催化胞苷三磷酸(ctp)和磷酸胆碱合成胞磷胆碱钠，此方法成本太高。
18、生物工作者针对酶催化合成法成本较高的缺点，开发了以胞苷酸和氯化胆碱为原料，多酶体系催化合成胞磷胆碱钠的方法(appl microbiol biotechnol 101:1409-1417)，反应式如下所示：
19、
20、此方法的优点是以成本更低的5’-胞苷酸和氯化胆碱替代价格昂贵的ctp和磷酸胆碱，利用atp再生体系循环利用atp降低其添加量，一定程度上降低了生产成本。但此方法的缺点是atp再生体系中乙酰磷酸盐的添加会抑制酶的催化活性，造成转化率不高，或者底物浓度不高。此方法还不具备产业化条件。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为提供一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法。所述多酶体系为构建的重组大肠杆菌工程菌pet28a-uck-bl21(de3)、pet28a-ppk-bl21(de3)、pet28a-cmk-bl21(de3)、pet28a-ndk-bl21(de3)、pet28a-cct-bl21(de3)和pet28a-cki-bl21(de3)所制备的重组酶胞苷-尿苷激酶(uck)、多聚磷酸酶(ppk)、胞苷酸激酶(cmk)、核苷二磷酸激酶(ndk)、磷酸胆碱胞苷酰转移酶(cct)和胆碱激酶(cki)的混合酶。其在三磷酸腺苷二钠、六偏磷酸钠做为磷源供体下催化胞苷、氯化胆碱合成胞磷胆碱钠。本专利技术有效地克服了现有胞磷胆碱钠制备方法中反应步骤复杂、收率低、成本较高、环境污染严重且安全隐患较多的问题，进而提供一种反应步骤简单、收率高、成本低、环保且安全的绿色制备胞磷胆碱钠的方法。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于：包括多酶体系为构建的重组大肠杆菌工程菌所制备的重组酶的混合酶；
3、构建的所述重组大肠杆菌工程菌包括pet28a-uck-bl21(de3)、pet28a-ppk-bl21(de3)、pet28a-cmk-bl21(de3)、pet28a-ndk-bl21(de3)、pet28a-cct-bl21(de3)和pet28a-cki-bl21(de3)；对应制备的重组酶分别为胞苷-尿苷激酶(uck)、多聚磷酸酶(ppk)、胞苷酸激酶(cmk)、核苷二磷酸激酶(ndk)、磷酸胆碱胞苷酰转移酶(cct)和胆碱激酶(cki)。
4、优选的，所述重组大肠杆菌工程菌pet28a-uck-bl21(de3)、pet28a-ppk-bl21(de3)、pet28a-cmk-bl21(de3)、pet28a-ndk-bl21(de3)、pet28a-cct-bl21(de3)和pet28a-cki-bl21(de3)通过以下步骤构建得到：设计引物以具有seq id no.7所示的序列结构的uck_ndei_f和具有seq id no.8所示的序列结构的uck_xhoi_r作为引物，以thermus本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于：包括多酶体系为构建的重组大肠杆菌工程菌所制备的重组酶的混合酶；
2.根据权利要求1所述的一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于：还包括设计引物以Thermus thermophiles(菌株编号ATCC 33923)基因组为模板PCR克隆SEQ ID NO.1所示的UCK基因(NCBI登录号为NZ_AQOS01000030.1)；
3.根据权利要求1所述的一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于：分别发酵培养所述重组大肠杆菌工程菌pET28a-UCK-BL21(DE3)、pET28a-PPK-BL21(DE3)、pET28a-CMK-BL21(DE3)、pET28a-NDK-BL21(DE3)、pET28a-CCT-BL21(DE3)和pET28a-CKI-BL21(DE3)，使其表达重组酶胞苷-尿苷激酶(UCK)、多聚磷酸酶(PPK)、胞苷酸激酶(CMK)、核苷二磷酸激酶(NDK)、磷酸胆碱胞苷酰转移酶(CCT)和胆碱激酶(CKI)；
4.根据权利
5.根据权利要求1所述的一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于：还包括一锅催化胞苷合成合成胞磷胆碱钠的方法，具体包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于：所述胞苷的底物浓度为30～50g/L；三磷酸腺苷二钠的浓度为0.6～1g/L；六偏磷酸钠的浓度为150～250g/L；氯化镁的浓度为15～30g/L；氯化胆碱的浓度为20～30g/L。
7.根据权利要求5所述的一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于：所述混合酶液的加入量为底物胞苷重量的100～200％。
8.根据权利要求5所述的一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于：所述离子交换树脂为强碱阴离子交换树脂D296，氯化钠洗脱液的浓度为0.05～0.1mol/L。
9.根据权利要求5所述的一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于：所述胞磷胆碱钠粗品进一步精制的步骤如下：
...【技术特征摘要】
1.一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于：包括多酶体系为构建的重组大肠杆菌工程菌所制备的重组酶的混合酶；
2.根据权利要求1所述的一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于：还包括设计引物以thermus thermophiles(菌株编号atcc 33923)基因组为模板pcr克隆seq id no.1所示的uck基因(ncbi登录号为nz_aqos01000030.1)；
3.根据权利要求1所述的一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于：分别发酵培养所述重组大肠杆菌工程菌pet28a-uck-bl21(de3)、pet28a-ppk-bl21(de3)、pet28a-cmk-bl21(de3)、pet28a-ndk-bl21(de3)、pet28a-cct-bl21(de3)和pet28a-cki-bl21(de3)，使其表达重组酶胞苷-尿苷激酶(uck)、多聚磷酸酶(ppk)、胞苷酸激酶(cmk)、核苷二磷酸激酶(ndk)、磷酸胆碱胞苷酰转移酶(cct)和胆碱激酶(cki)；
4.根据权利要求3所述的一种多酶体系一锅催化胞苷合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于：所述重组胞苷-尿苷激酶(...
【专利技术属性】
技术研发人员：李国庆，
申请(专利权)人：深圳华酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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