【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于磁性材料固定化酶，主要涉及一种磁性纳米颗粒固定化磷脂酶的制备方法。
技术介绍
1、酶具有高效、专一以及生物相容等特性，是食品生产、生物医药以及化学催化的首选材料。磷脂酶是一种脂解酶，可在特定的酯键上水解磷脂底物，在许多生理过程中发挥重要作用，包括磷脂代谢、信号转导、细胞周期进展和炎症反应。磷脂酶lm是磷脂酶a2的改性酶，具有较高的热稳定性，可以催化磷脂中sn-2酯键的水解，产生溶血磷脂酰胆碱酸和游离脂肪酸。磷脂酶3g是磷脂酶c、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶c以及极少量磷脂酶a2的混合酶，主要应用于油脂精炼、改性等领域。然而，酶经常因成本高、操作稳定性差和难以回收再利用而在工业应用中受到限制。为了克服这些缺点，开发了酶固定化技术，既能保留酶的生物化学催化特性，又能实现重复利用，降低成本，提高工业适用性。
2、酶固定化处理是提高酶蛋白稳定性的有效方法。酶固定化效率决定了固定化酶的有效性，例如稳定性、酶活性和可重复使用性等，主要取决于载体的设计、功能和性质等因素。目前，已有各种有机/无机材料用于酶的固定化。但是，回收困难的问题仍然存在。基于传统固定酶法的不足，磁性纳米颗粒固定化酶方法受到研究人员的关注。一方面，磁性纳米颗粒具有高分散性、高表面积，提高了酶分子的功能化固定位点，并赋予固定化酶良好的回收率和重复使用性。另一方面，磁性纳米固定化酶仍保留酶的活性，增强其催化性能，提高操作稳定性和储藏稳定性。最常用的固定机制包括物理方法(吸附和包埋)和化学相互作用(共价键、静电相互作用、氢键、疏水相互作用和范德华力)。物理吸
3、本专利技术以fe3o4@sio2@cs-cooh磁性纳米颗粒为载体对游离的磷脂酶进行固定化处理，相比于游离酶，固定化酶不仅催化效率高、专一性好，并且增强了对恶劣条件的抗性，延长了酶的使用寿命。同时，磁性固定化酶便于与反应产物分离，简化生产工艺，降低成本。为磁性纳米颗粒固定化酶的稳定性研究提供理论支撑，可以广泛应用于不同类型酶分子的固定化中，在生物技术和油脂精炼的产业化应用具有重要的指导意义。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种磁性纳米颗粒固定化磷脂酶的制备方法，利用磁性纳米颗粒表面较多的功能修饰位点，提高磷脂酶的固定化效率，增强固定化酶的稳定性，并同时保留较高的酶活性，实现磷脂酶的高效重复利用，增强该载体在酶蛋白固定化中的应用。
2、本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
3、一种磁性纳米颗粒固定化磷脂酶的制备方法，该方法包括以下步骤：
4、(1)将feso4·7h2o和fecl3·6h2o按摩尔比1:2溶于120ml蒸馏水中(溶液a)，称取0.8960g naoh和6.8900g naac溶于80ml蒸馏水中(溶液b)，将超声粉碎机的超声探头置于溶液b中，向其缓慢滴加溶液a并同时开始超声化学反应(80w，30min)，得到fe3o4磁性纳米颗粒；称取2g fe3o4超声分散于含160ml无水乙醇、40ml蒸馏水和5ml 25％氨水的溶液中，30min后加入5ml正硅酸四乙酯，机械搅拌20h，得到fe3o4@sio2磁性纳米颗粒；将0.4g壳聚糖(cs)溶于100ml 1.5％乙酸溶液中，再加入2g fe3o4@sio2，在50℃水浴加热下搅拌均匀，45min后加入naoh调节溶液ph至13.0，得到fe3o4@sio2@cs磁性纳米颗粒；在4％乙二胺四乙酸水溶液中，加入1.0g n-(3-二甲基氨基丙基)-n′-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和0.8g n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，搅拌4h后，加入1g fe3o4@sio2@cs，继续搅拌12h，得到fe3o4@sio2@cs-cooh磁性纳米颗粒；
5、(2)称取fe3o4@sio2@cs-cooh磁性纳米颗粒50mg，加入2ml edc溶液和5ml nhs溶液，在室温下活化0～120min；
6、(3)磁性纳米颗粒活化完成后，加入40～120μl ph 2.5～6.5的磷脂酶酶液(磷脂酶lm、磷脂酶3g)；
7、(4)将磁性纳米颗粒与酶液混合物在20～40℃恒温水浴摇床中继续反应1～5h；
8、(5)将悬浮液磁分离并吸出上清液，用磷酸盐缓冲液洗涤磁性固定化酶数次至无蛋白检出，洗涤液并入上清液中，将磁性固定化酶与上清液储存在4℃下备用。
9、优选的，步骤(2)中磁性纳米颗粒活化时间为30min。
10、优选的，步骤(3)中磷脂酶lm酶液的添加量为60μl，ph值为2.5。
11、优选的，步骤(3)中磷脂酶3g酶液的添加量为100μl，ph值为5.5。
12、优选的，步骤(4)中磁性纳米颗粒与磷脂酶lm酶液反应温度为30℃，反应时间为3h。
13、优选的，步骤(4)中磁性纳米颗粒与磷脂酶3g酶液反应温度为30℃，反应时间为3h。
14、本专利技术选用fe3o4@sio2@cs-cooh磁性纳米颗粒对磷脂酶lm和磷脂酶3g进行固定化处理，得到磁性固定化磷脂酶，固定化处理保留了酶的空间结构和活性中心，进而保留了酶的活性，并且提高酶的稳定性。磁性固定磷脂酶具有较强的磁响应性能，能使底物与产物高效分离，提高酶的重复使用率，降低生产成本，有利于实现连续化生产。
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1.一种磁性纳米颗粒固定化磷脂酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中磁性纳米颗粒活化时间为30min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中磷脂酶LM酶液的添加量为60μL，pH值为2.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中磷脂酶3G酶液的添加量为100μL，pH值为5.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中磁性纳米颗粒与磷脂酶LM酶液反应温度为30℃，反应时间为3h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中磁性纳米颗粒与磷脂酶3G酶液反应温度为30℃，反应时间为3h。
【技术特征摘要】
1.一种磁性纳米颗粒固定化磷脂酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中磁性纳米颗粒活化时间为30min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中磷脂酶lm酶液的添加量为60μl，ph值为2.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：滕飞，陈乐，谭湘芸，刘悦，尚柏余，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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