【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是涉及一种植物单倍体诱导系的制备方法。
技术介绍
1、棉花是我国最重要的天然纤维作物，2021年棉花播种面积超过3100万亩。优良棉花纯系的选育是棉花利用杂种优势、选育优良品种的基础和关键。但传统选育方法一般需要6个世代以上才能获得较为纯合的自交系材料，而利用单倍体育种技术则只需2个世代，大大缩短育种年限。目前，在玉米中单倍体育种技术作为一种快速获得纯系的方法，已经被国内外众多种业公司规模化应用。玉米中已克隆了2个主效单倍体诱导qtl，其中一个为磷脂酶基因zmpla1，该基因功能丧失突变能够诱导单倍体的产生(kelliher,t.et al.,matrilineal,a sperm-specific phospholipase,triggers maize haploidinduction.nature,2017.542:105-109)。然而zmpla1在双子叶植物中没有直系同源基因。另一个编码duf679结构域膜蛋白(duf679 domain membrane protein)的基因zmdmp，该基因突变后能在zmpla1基因的基础上进一步提高单倍体诱导能力，而且zmdmp基因单突变也具备单倍体诱导能力(zhong,y.et al.,mutation ofzmdmp enhances haploid inductionin maize.nat.plants,2019,5,575-580)。而棉花中由于单倍体诱导技术的限制，单倍体育种还未得到广泛应用。zmpla1和zmdmp在棉花中的应用潜力还未知。
2、目前天然的单倍体诱导系诱导概率低，也还未有开发棉花单倍体诱导系的创制研究报道，传统选育效率低下，耗时长，有必要开发新型单倍体诱导基因资源与技术。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是如何提供一种棉花单倍体诱导系。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
2、为了解决以上技术问题，本专利技术首先提供了一种植物单倍体诱导系的制备方法，包括如下步骤：敲除目的植物基因组中ghse基因得到的ghse基因被敲除的植物即为植物单倍体诱导系；
3、所述ghse基因编码如下任一种蛋白质：
4、a)氨基酸序列是seq id no.2所示的蛋白质；
5、b)在seq id no.2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；
6、c)将seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
7、d)与seq id no.2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。
8、所述标签蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his6标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。
9、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本专利技术的编码蛋白质ghse的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的蛋白质ghse的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质ghse且具有蛋白质ghse功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。
10、上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
11、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
12、本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
13、进一步地，敲除目的植物基因组中ghse基因的物质可为任何能够使植物中编码ghse蛋白质的基因发生突变(所述突变形式可为缺失突变和/或插入突变和/或碱基替换)从而失去活性的物质，如锌指蛋白zfn基因编辑系统或talens基因编辑系统或crispr/cas9基因编辑系统等。
14、更进一步地，所述敲除目的植物基因组中ghse基因的物质为crispr/cas9基因编辑系统。所述crispr/cas9系统具体为将seq id no.1所示的sgrna的编码dna分子插入prgeb32-ghu6.9-nptii载体后得到的载体。
15、更进一步地，所述敲除目的植物基因组中ghse基因为所述敲除目的棉花基因组中ghse基因，所述敲除目的棉花基因组中ghse基因为下述任一种：
16、1)缺失棉花基因组中seq id no.4的第433位到第434位的tc这两个核苷酸；
17、2)在seq id no.4的第434位到第445位的之间插入了一个碱基t；
18、3)缺失了seq id no.4的第422位到第443位共计22个核苷酸序列，缺失片段序列为5`-ttcaaaaggattctggaaggtc-3`。
19、所述ghse基因可为编码序列(cds)是seq id no.1的dna分子。
20、进一步地，上述制备方法中所述植物为双子叶植物，具体可为棉花。更进一步地，所述棉花为野生型棉花jin668。
21、进一步地，上述制备方法中所述ghse基因为编码序列(cds)是seq id no.1的dna分子或核苷酸序列是seq id no.4的第100-2282位的dna分子。
22、进一步地，上述制备方法中所述crispr/cas9系统的靶序列为seq id no.1第320-339位或为seq id no.4的第一外显子的第419-438位。
23、进一步地，上述制备方法中所述crispr/cas9系统包括sgrna的编码dna分子，所述sgrna的编码dna分子为seq id no.3所示的dna分子。
24、本专利技术还提供了一种植物单倍体的制备方法，包括如下本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种植物单倍体诱导系的制备方法，包括如下步骤：敲除目的植物基因组中GhSE基因得到的GhSE基因被敲除的植物即为植物单倍体诱导系；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述敲除通过CRISPR/Cas9系统实现。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物为棉花。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述GhSE基因为编码序列(CDS)是SEQ IDNo.1的DNA分子或核苷酸序列是SEQ ID No.4的第100-2282位的DNA分子。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系统的靶序列为SEQ IDNo.1第320-339位。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系统包括sgRNA的编码DNA分子，所述sgRNA的编码DNA分子为SEQ ID No.3所示的DNA分子。
7.一种植物单倍体的制备方法，包括如下步骤：将由权利要求1-6中任一所述的方法制备的植物单倍体诱导系或其后代进行自交，得到自交后代，从所述自交后代
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：将所述自交后代的单株进行单倍体性状鉴定和/或叶片倍性鉴定，选取至少一种方法鉴定为单倍体的后代单株为植物单倍体。
9.如下1)-6)任一种应用：
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述编码基因为编码序列是SEQ IDNo.2的DNA分子。
...【技术特征摘要】
1.一种植物单倍体诱导系的制备方法，包括如下步骤：敲除目的植物基因组中ghse基因得到的ghse基因被敲除的植物即为植物单倍体诱导系；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述敲除通过crispr/cas9系统实现。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物为棉花。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述ghse基因为编码序列(cds)是seq idno.1的dna分子或核苷酸序列是seq id no.4的第100-2282位的dna分子。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述crispr/cas9系统的靶序列为seq idno.1第320-339位。
6.根据权利要求4或5所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：张永山，陈伟，姚金波，李燕，朱守鸿，房圣涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：
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