【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，具体涉及kras基因突变检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
1、结直肠癌是全世界第三常见的癌症，约占所有癌症病例的10％。近年来，结直肠癌发病率和死亡率均保持上升趋势。
2、kras基因编码gtp/gdp结合蛋白，与hras和nras同属于ras基因家族。kras蛋白可激活多条与癌症相关的下游信号通路，包括mapk信号通路，pi3k信号通路等，这些信号通路在促进细胞生存、增殖和细胞因子释放方面具有重要作用。kras发生突变时，gtp的水解被破坏和/或核苷酸交换增强，kras持续处于活性状态，导致下游信号通路的持续激活，从而促进肿瘤细胞增殖。kras基因的突变具有多种亚型，不同种的亚型对患者的预后可能有不同的影响。在结直肠癌中，kras的突变主要发生在3个位点(12，13和61密码子)，其中g12d突变为主要突变，约为40.43％、其他突变包括g12v突变约为34.75％、g12c约为10.64％。目前只有g12c突变可使用mrtx849等靶向药物，其他kras基因突变，如kras g12d、kras g12v、kras g13d等均没有明确的靶向药物。因此，检测kras基因突变可用于指导结直肠癌患者的用药和治疗方案修正，是重要的分子检测标志物。
3、目前，针对kras基因检测所使用的样本中绝大部分是采用新鲜组织、东冻存组织和石蜡包埋组织样本进行检测，但组织基因检测并非对每个患者都适用，有的肿瘤没法取出足够的组织进行测序，还有一部分患者由于肿瘤较小，不能进行穿刺，因而
4、目前检测kras基因突变的方法主要有sanger法、荧光pcr法、数字pcr法、高通量测序等。其中sanger法仍然是突变检测的金标准，但是这种方法的灵敏度不高，要求突变率达到20％～30％时，才能被检出；高通量测序虽然通量大，但操作流程繁琐、成本高，而且测序结果需要专业生信人员分析；数字pcr法的灵敏度较高，但所需的试剂和耗材价格昂贵，而且操作流程繁琐；荧光pcr法检测kras基因突变，具有灵敏度高，特异性高，且检测便捷快速等优势，目前在临床应用广泛，但其检测通量低，一般一个反应孔只能检测一个突变位点，导致多靶点检测时样本需求量较高。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本专利技术旨在提供一种检测结直肠癌循环肿瘤细胞kras基因突变的荧光pcr试剂盒及其检测方法，以实现从单个细胞水平上对kras进行检测。其技术方案如下：
2、一种检测结直肠癌循环肿瘤细胞kras基因突变的荧光pcr试剂盒，包括用于检测kras基因突变所需的kras特异性引物和kras探针、内参基因引物和内参基因探针；所述kras特异性引物，用于扩增待测单个循环肿瘤细胞样本中的目标区域以得到扩增产物；所述特异性引物包括第一上游引物、第一下游引物；
3、所述kras探针，用于在所述扩增产物生成过程中进行水解反应，释放荧光信号；
4、所述内参基因引物，用于扩增所述待测ctc中的管家基因以得到扩增产物，所述内参基因引物包括内参上游引物和内参下游引物；
5、所述内参基因探针，用于在所述扩增产物生成过程中进行水解反应，释放荧光信号。
6、进一步的，所述第一上游引物对应的核苷酸序列为seq id no:1。
7、进一步的，第一下游引物对应的核苷酸序列为seq id no:2。
8、进一步的，所述kras探针对应的核苷酸序列包括seq id no:3和seq id no:4；其中，所述seq id no:3对应的核苷酸序列的5’端标记有vic，所述seq id no:4对应的核苷酸序列的5’端标记有fam。
9、进一步的，所述内参上游引物对应的核苷酸序列包括seq id no:5，所述内参下游引物对应的核苷酸序列包括seq id no:6。
10、进一步的，所述内参基因探针对应的核苷酸序列包括seq id no:7，其中，所述seqid no:7对应的核苷酸序列的5’端标记有fam。
11、进一步的，所述荧光pcr试剂盒包括商业化thunderbirdtm next probe qpcrmix、引物探针混合液、对照样本和纯化水。
12、进一步的，所述引物探针混合液为所述kras特异性引物及探针、内参基因引物和内参基因探针配制得到；所述商业化thunderbirdtm next probe qpcr mix、引物探针混合液、与所述纯化水混合配制得到pcr反应液。
13、进一步的，所述对照样本包括阴性对照和阳性对照。
14、一种kras基因突变检测方法，使用所述的荧光pcr试剂盒进行检测，包括如下步骤：
15、步骤一、采集待测外周血，负向富集后进行ctc鉴定并挑取单细胞ctc样本；
16、步骤二、利用商业化单细胞逆转录试剂盒对所述待测单个循环肿瘤细胞样本进行rna提取、逆转录扩增；
17、步骤三、所得cdna产物进行增强pcr扩增程序；
18、步骤四、利用所述荧光pcr试剂盒中的kras特异性引物对上述预扩增产物的目标区域进行扩增，得到扩增产物，并在所述第一扩增产物生成过程中，所述kras探针进行水解反应，释放荧光信号；
19、步骤五、利用所述荧光pcr试剂盒中的内参基因引物对所述待测样本中的管家基因进行扩增，得到扩增产物，并在所述扩增产物生成过程中，所述内参基因探针进行水解反应，释放荧光信号。
20、步骤六、在荧光定量pcr仪上进行检测，分析扩增曲线和ct值。
21、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
22、1、本专利技术采用booster pcr与drop-off方法相结合，在mrna水平上同时检测单个ctc细胞中kras基因多个突变位点，降低了检测成本，并在一定程度上解决了荧光pcr法通量低等缺陷。
23、2、实现低至单个细胞水平的分子分型分析，为以后单细胞下游分子检测提供参考价值，并且有助于及早的了解患者对药物治疗的敏感性。
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1.一种检测结直肠癌循环肿瘤细胞KRAS基因突变的荧光PCR试剂盒，包括用于检测KRAS基因突变所需的KRAS特异性引物和KRAS探针、内参基因引物和内参基因探针；其特征在于：
2.如权利要求1所述的检测结直肠癌循环肿瘤细胞KRAS基因突变的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述第一上游引物对应的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
3.如权利要求1所述的检测结直肠癌循环肿瘤细胞KRAS基因突变的荧光PCR试剂盒，其特征在于：第一下游引物对应的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
4.如权利要求1所述的检测结直肠癌循环肿瘤细胞KRAS基因突变的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述KRAS探针对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；其中，所述SEQ ID NO:3对应的核苷酸序列的5’端标记有VIC，所述SEQ ID NO:4对应的核苷酸序列的5’端标记有FAM。
5.如权利要求1所述的检测结直肠癌循环肿瘤细胞KRAS基因突变的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述内参上游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:
6.如权利要求1所述的检测结直肠癌循环肿瘤细胞KRAS基因突变的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述内参基因探针对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:7，其中，所述SEQ ID NO:7对应的核苷酸序列的5’端标记有FAM。
7.如权利要求1所述的检测结直肠癌循环肿瘤细胞KRAS基因突变的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述荧光PCR试剂盒包括商业化THUNDERBIRDTM Next Probe qPCR Mix、引物探针混合液、对照样本和纯化水。
8.如权利要求7所述的检测结直肠癌循环肿瘤细胞KRAS基因突变的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述引物探针混合液为所述KRAS特异性引物及探针、内参基因引物和内参基因探针配制得到；所述商业化THUNDERBIRDTM Next Probe qPCR Mix、引物探针混合液、与所述纯化水混合配制得到PCR反应液。
9.如权利要求7所述的检测结直肠癌循环肿瘤细胞KRAS基因突变的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述对照样本包括阴性对照和阳性对照。
10.一种KRAS基因突变检测方法，使用如权利要求1-9之一所述的荧光PCR试剂盒进行检测，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种检测结直肠癌循环肿瘤细胞kras基因突变的荧光pcr试剂盒，包括用于检测kras基因突变所需的kras特异性引物和kras探针、内参基因引物和内参基因探针；其特征在于：
2.如权利要求1所述的检测结直肠癌循环肿瘤细胞kras基因突变的荧光pcr试剂盒，其特征在于：所述第一上游引物对应的核苷酸序列为seq id no:1。
3.如权利要求1所述的检测结直肠癌循环肿瘤细胞kras基因突变的荧光pcr试剂盒，其特征在于：第一下游引物对应的核苷酸序列为seq id no:2。
4.如权利要求1所述的检测结直肠癌循环肿瘤细胞kras基因突变的荧光pcr试剂盒，其特征在于：所述kras探针对应的核苷酸序列包括seq id no:3和seq id no:4；其中，所述seq id no:3对应的核苷酸序列的5’端标记有vic，所述seq id no:4对应的核苷酸序列的5’端标记有fam。
5.如权利要求1所述的检测结直肠癌循环肿瘤细胞kras基因突变的荧光pcr试剂盒，其特征在于：所述内参上游引物对应的核苷酸序列包括seq id no:5，所述内参下游引物对应的核苷酸序列包括seq id no:6。
【专利技术属性】
技术研发人员：高阳，韩改净，
申请(专利权)人：北京航空航天大学杭州创新研究院，
类型：发明
国别省市：
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