【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种特异性人源基因片段及其检测引物和/或探针、标准质粒和应用，属于生物。本案是申请号为202310176605.5，专利技术名称为《一种特异性人源基因片段及其检测引物和/或探针、标准质粒和检测方法》的分案。
技术介绍
1、近年来(干)细胞治疗作为生物医药产业的新兴技术，成为糖尿病、关节炎、神经系统等疾病领域的研究热点，被各国列为重点支持领域。由于(干)细胞具有增殖和自主趋化的能力，并且表面具有一定的生物靶向性质，其体内药学特征与传统的小分子和大分子药物差异很大，传统的药代动力学研究方法无法对其进行全面且准确的监测。而(干)细胞治疗产品在体内的分布和代谢与其药效有直接的联系，所以临床前的药代动力学研究十分关键。因此对于临床前安全性的评价，一种能监测其在动物体内分布的方法就非常重要。
2、使用荧光定量pcr(qpcr)检测体液或组织中人源核酸的方法，因qpcr方法特异性强、灵敏度高，在(干)细胞药物的临床前体内检测中占据重要地位；然而由于人与各种模式动物基因同源性较高，存在设计的引物探针及其检测的靶基因特异性不足、不能同时检测多种动物体内的人源核酸、操作难度高等缺点。
3、alu元件是灵长类动物特异性元件(sines)，长度约为300个核苷酸。人类基因组中有超过100万个alu拷贝，占整个基因组的10％以上。由于其物种特异性、小尺寸和极高的拷贝数，alu元件是qpcr检测其他动物物种细胞内人类细胞的绝佳靶标，并已有开发出市售试剂盒。
4、但是alu检测存在诸多问题，alu序列为高度重
技术实现思路
1、专利技术目的：针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种用于检测多种动物体内的人源核酸的特异性人源基因片段；本专利技术的另一目的是提供一种具备高特异性的检测上述特异性人源基因片段的引物和/或探针；本专利技术的再一目的是提供一种具备高特异性的检测上述特异性人源基因片段的标准质粒及其构建方法；本专利技术的还一目的是提供一种具备高特异性、高灵敏度的检测上述人源基因片段的方法。
2、技术方案：本专利技术所述的一种特异性人源基因片段为cftr基因片段，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
3、特异性检测上述人源基因片段的引物和/或探针。
4、进一步地，所述引物的核苷酸序列包括如seq id no.2所示的上游引物cftr-f和如seq id no.3所示的下游引物cftr-r；探针cftr-p的核苷酸序列如seq id no.4所示。所述探针cftr-p的5’端标记有6-fam，探针cftr-p的3’端标记有mgb。
5、特异性检测上述人源基因片段的标准质粒包含seq id no.1的全部或部分核苷酸序列。
6、上述标准质粒的构建方法，包括以下步骤：
7、(1)设计pcr特异性引物：上游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.6所示；
8、(2)获取目的片段：利用上述pcr特异性引物扩增目的片段；
9、(3)质粒的构建：上述得到的pcr产物回收后，通过t4dna连接酶连接到pucm-t载体上，连接后的产物转化至大肠杆菌dh5α建立转化感受态细胞，培养后得到标准质粒。
10、进一步地，步骤(2)中所述的目的片段的核苷酸序列如seq id no.7所示。
11、上述引物、探针或/和标准质粒在检测人源基因组dna的试剂盒中的应用。
12、本专利技术所述的一种特异性检测上述人源基因片段的方法(cftr-qpcr)，包括以下步骤：
13、(1)构建所述的标准质粒；
14、(2)用稀释液将标准质粒梯度稀释至浓度为1×101～1×107copies/μl的溶液作为标准液，并绘制标准曲线；
15、(3)提取待测样品dna作为扩增模板，并建立如下pcr反应体系：2×qpcr mix、cftr-f、cftr-r、cftr-p、无菌无酶水、扩增模板；将以上反应体系进行pcr扩增，记录ct值，带入步骤(2)中绘制的标准曲线，即可得到待测样品中的人源基因的含量。
16、进一步地，步骤(3)中所述待测样品dna包括食蟹猴/恒河猴、大白兔、大鼠、小鼠的dna。
17、本专利技术所述的一种特异性人源基因片段为st6gal1基因片段，其核苷酸序列如seqid no.9所示。
18、特异性检测上述st6gal1基因片段的引物和/或探针。
19、进一步地，所述引物的核苷酸序列包括如seq id no.10所示的上游引物st6gal1-f和如seq id no.11所示的下游引物st6gal1-r；探针st6gal1-p的核苷酸序列如seq idno.12所示。所述探针st6gal1-p的5’端标记有6-fam，探针st6gal1-p的3’端标记有mgb。
20、特异性检测上述人源基因片段的标准质粒包含seq id no.9的全部或部分核苷酸序列。
21、上述标准质粒的构建方法，包括以下步骤：
22、(1)设计pcr特异性引物：上游引物的核苷酸序列如seq id no.13所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.14所示；
23、(2)获取目的片段：利用上述pcr特异性引物扩增目的片段；
24、(3)质粒的构建：上述得到的pcr产物回收后，通过t4dna连接酶连接到pucm-t载体上，连接后的产物转化至大肠杆菌dh5α建立转化感受态细胞，培养后得到标准质粒。
25、进一步地，步骤(2)中所述的目的片段的核苷酸序列如seq id no.15所示。
26、上述引物、探针或/和标准质粒在检测st6gal1基因片段的试剂盒中的应用。
27、本专利技术所述的一种特异性检测上述st6gal1基因片段的方法(st6gal1-qpcr)，包括以下步骤：
28、(1)构建所述的标准质粒；
29、(2)用稀释液将标准质粒梯度稀释至浓度为1×101～1×107copies/μl的溶液作为标准液，并绘制标准曲线；
30、(3)提取待测样品dna作为扩增模板，并建立如下pcr反应体系：2×qpcr mix、st6gal1-f、st6gal1-r、st6gal1-p、无菌无酶水、扩增模板；将以上反应体系进行pcr扩增，记录ct值，带入步骤(2)中绘制的标准曲线，即可得到待测样品中的人源基因的含量。
31、进一步地，步骤(3)中所述待测样品dna包括食蟹猴/恒河猴、大白兔、大鼠、小鼠的dna。
32、有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下突出的显著优点：本申请提供的引物、探针和标准质粒可用于检本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种ST6GAL1基因片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
2.一种检测权利要求1所述的ST6GAL1基因片段的引物和/或探针。
3.根据权利要求2所述的引物和/或探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.10所示的上游引物ST6GAL1-F和如SEQ ID NO.11所示的下游引物ST6GAL1-R；探针ST6GAL1-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
4.一种检测权利要求1所述的ST6GAL1基因片段的标准质粒，其特征在于，所述标准质粒包含SEQ ID NO.9的全部或部分核苷酸序列。
5.一种权利要求4所述的标准质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的标准质粒的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
7.一种权利要求2～3任一项所述的引物和/或探针和/或权利要求4所述的标准质粒在制备检测ST6GAL1基因片段的试剂盒中的应用。
8.一种特异性检测权
9.根据权利要求8所述的一种特异性检测权利要求1所述的ST6GAL1基因片段的方法，其特征在于，步骤(3)中所述待测样品DNA包括食蟹猴/恒河猴、大白兔、大鼠、小鼠的DNA。
...【技术特征摘要】
1.一种st6gal1基因片段，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.9所示。
2.一种检测权利要求1所述的st6gal1基因片段的引物和/或探针。
3.根据权利要求2所述的引物和/或探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列包括如seq id no.10所示的上游引物st6gal1-f和如seq id no.11所示的下游引物st6gal1-r；探针st6gal1-p的核苷酸序列如seq id no.12所示。
4.一种检测权利要求1所述的st6gal1基因片段的标准质粒，其特征在于，所述标准质粒包含seq id no.9的全部或部分核苷酸序列。
5.一种权利要求4...
【专利技术属性】
技术研发人员：阮海文，徐玉英，侯乐乐，陈计霞，程远国，张雪峰，
申请(专利权)人：江苏鼎泰药物研究集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。