【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水产动物养殖，具体涉及一种含有低温蛋白酶和后生元制剂的小龙虾肠道微生态添加剂及其制备方法和应用。
技术介绍
1、蛋白酶制剂在养殖中领域中广泛使用，不仅可以提高蛋白类饲料原料的消化吸收率，促进动物增重，又可以减少排泄物，减少环境污染。但是目前常用的蛋白酶尤其是对饲料原料中蛋白降解效果较好的碱性蛋白酶，其最适反应温度一般为50-60℃左右，在20℃-40℃条件下的酶活或者催化活性一般不高。然而，动物养殖和肠道环境大多是20℃-40℃，所以对蛋白酶基因进行优化和改造，获得更适合在低温下保持较高活性的酶制剂是解决这一问题的有效方法。
2、后生元是指“对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂”，这包括了灭活的益生菌细胞及其代谢产物。具体组分涉及广泛，主要包括：灭活的益生菌细胞成分：肽聚糖（pg）、磷壁酸（ta）、脂磷壁酸（lta）、细胞膜蛋白、细胞壁多糖（cpss）等。 益生菌代谢产物：酶、蛋白质、多肽、胞外多糖、有机酸、短链脂肪酸等。 微生物代谢的酶处理底物释放的小分子活性物质：这些物质具有直接的生物活性，能够在不需活菌的情况下对宿主产生作用。在养殖动物中，后生元的应用显示出多方面的积极作用： 提升生产性能、 增强免疫力、调节肠道微生态、改善应激反应、促进营养吸收、代谢调节等等，进一步优化生产性能。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供了一种含有低温蛋白酶和后生元制剂的小龙虾肠道微生态添加剂及其制备方法和应用。本专利技术通过在小龙虾养殖中应用蛋白酶及后生
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
3、本专利技术提供了一种低温蛋白酶突变体aprem，其氨基酸序列如seq id no：1所示，aprem由氨基酸序列为seq id no：3的蛋白酶第38位氨基酸由赖氨酸变为天冬氨酸，第102位氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸，第183位氨基酸由天冬酰胺变为苏氨酸以及第210位氨基酸由酪氨酸变为甲硫氨酸得到。
4、本专利技术还提供了低温蛋白酶突变体aprem的编码基因，其核苷酸序列如seq idno：2所示。
5、本专利技术还提供了包含所述编码基因的重组表达载体，所述载体为pwb980或ppic9k。
6、本专利技术提供了包含所述编码基因的的基因工程菌，所述基因工程菌为毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。
7、本专利技术提供了一种含有低温蛋白酶和后生元制剂的小龙虾肠道微生态添加剂，所述微生态添加剂包含有所述的低温蛋白酶突变体aprem酶制剂和后生元制剂。
8、进一步的，所述微生态添加剂的制备方法包括以下步骤：
9、（1）先将含有所述蛋白酶突变体aprem的重组菌进行发酵，发酵结束后，先离心获得上清液再浓缩提取制备低温蛋白酶制剂；
10、（2）剩余的发酵代谢物和菌体进行灭活和喷干制备成后生元制剂；
11、（3）将所述低温蛋白酶制剂和后生元制剂按照质量比为1:3~5混合制得微生态添加剂。
12、进一步的，所述蛋白酶突变体aprem重组菌的发酵培养基配方为：豆粕2-5%，玉米淀粉3-5%，中性蛋白酶1000u/g，高温淀粉酶1000u/g，葡萄糖3-5%，硫酸铵0.1-0.5%，硫酸镁0.01-0.1%，氯化钙0.01-0.1%，磷酸二氢钾0.2-0.8%，吐温80 0.02-0.05%，玉米浆3-10%，以质量比计。
13、本专利技术还提供了低温蛋白酶突变体aprem或所述的肠道微生态添加剂在用于水产动物养殖的饲料添加剂中的应用。
14、进一步的：所述水产动物包括小龙虾、对虾。
15、进一步的：将低温蛋白酶突变体aprem酶制剂或肠道微生态添加剂作为饲料添加剂混入小龙虾日粮中添加，按照日投喂量占小龙虾体重的质量比例，幼虾阶段的日投喂比例为4-6%，成熟后小龙虾的日投喂比例为3-5%，所述肠道微生态添加剂按照0.2%-0.5%的添加量添加到日粮中投喂；或者通过泼洒到养殖水体中使用，养殖水体中种植覆盖率在40%-50%的伊乐藻和轮叶黑藻。
16、进一步的：所述肠道微生态添加剂能够抑制养殖水体中的弧菌。
17、与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术对 apre碱性蛋白酶基因（genbank: wp_029726299.1）进行改良，通过分析选取多个候选位点进行定点突变，构建突变体文库和高通量定向筛选的方法，通过大量筛选获得低温条件下酶活力提高的低温蛋白酶突变体aprem，其突变点为k38d/i102v/n183t/y210m。本专利技术改造后的突变体aprem最适反应温度由55℃降至45℃，并且酶活力在20-40℃反应条件下保持60%以上，经过15l发酵罐发酵，蛋白酶产酶水平达到6000u/ml。
18、本专利技术将低温蛋白酶结合后生元制剂应用在小龙虾养殖中，不仅能够提高养殖效率和动物健康水平，还能改善水体，在养殖水产动物领域展现出了良好的应用潜力，对推动绿色健康养殖具有重要意义。
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1.一种低温蛋白酶突变体aprEM，其特征在于，所述低温蛋白酶突变体aprEM的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，aprEM由氨基酸序列为SEQ ID NO：3的蛋白酶第38位氨基酸由赖氨酸变为天冬氨酸，第102位氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸，第183位氨基酸由天冬酰胺变为苏氨酸以及第210位氨基酸由酪氨酸变为甲硫氨酸得到。
2.权利要求1所述的低温蛋白酶突变体aprEM的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.包含权利要求2所述编码基因的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pWB980或pPIC9K。
4.包含权利要求2所述编码基因的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
5.一种含有低温蛋白酶和后生元制剂的小龙虾肠道微生态添加剂，其特征在于，所述微生态添加剂包含有权利要求1所述的低温蛋白酶突变体aprEM酶制剂和后生元制剂。
6.根据权利要求5所述的小龙虾肠道微生态添加剂，其特征在于，所述微生态添加剂的制备方法
7.根据权利要求6所述的小龙虾肠道微生态添加剂，其特征在于，所述蛋白酶突变体aprEM重组菌的发酵培养基配方为：豆粕2-5%，玉米淀粉3-5%，中性蛋白酶1000U/g，高温淀粉酶1000U/g，葡萄糖3-5%，硫酸铵0.1-0.5%，硫酸镁0.01-0.1%，氯化钙0.01-0.1%，磷酸二氢钾0.2-0.8%，吐温80 0.02-0.05%，玉米浆3-10%，以质量比计。
8.权利要求1所述的低温蛋白酶突变体aprEM或权利要求5所述的肠道微生态添加剂在用于水产动物养殖的饲料添加剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将低温蛋白酶突变体aprEM酶制剂或肠道微生态添加剂作为饲料添加剂混入小龙虾日粮中添加，按照日投喂量占小龙虾体重的质量比例，幼虾阶段的日投喂比例为4-6%，成熟后小龙虾的日投喂比例为3-5%，所述肠道微生态添加剂按照0.2%-0.5%的添加量添加到日粮中投喂；或者通过泼洒到养殖水体中使用，养殖水体中种植覆盖率在40%-50%的伊乐藻和轮叶黑藻。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肠道微生态添加剂能够抑制养殖水体中的弧菌。
...【技术特征摘要】
1.一种低温蛋白酶突变体aprem，其特征在于，所述低温蛋白酶突变体aprem的氨基酸序列如seq id no：1所示，aprem由氨基酸序列为seq id no：3的蛋白酶第38位氨基酸由赖氨酸变为天冬氨酸，第102位氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸，第183位氨基酸由天冬酰胺变为苏氨酸以及第210位氨基酸由酪氨酸变为甲硫氨酸得到。
2.权利要求1所述的低温蛋白酶突变体aprem的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no：2所示。
3.包含权利要求2所述编码基因的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pwb980或ppic9k。
4.包含权利要求2所述编码基因的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
5.一种含有低温蛋白酶和后生元制剂的小龙虾肠道微生态添加剂，其特征在于，所述微生态添加剂包含有权利要求1所述的低温蛋白酶突变体aprem酶制剂和后生元制剂。
6.根据权利要求5所述的小龙虾肠道微生态添加剂，其特征在于，所述微生态添加剂的制备方法包括以下步骤：
【专利技术属性】
技术研发人员：殷文健，张宪中，何俊，刘颖，沈勇平，
申请(专利权)人：无锡市水产畜牧技术推广中心无锡市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：
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