【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及高分子化学药物及部分生物领域，具体涉及到一种ph响应型多臂聚前药纳米颗粒的制备方法和应用。
技术介绍
1、主要结直肠癌（crc）作为全球癌症相关死亡的主要原因之一，其发病率与死亡率均呈逐年上升趋势。许多慢性炎症性肠病 （ibd） 患者会发展为结肠炎相关结直肠癌（cac）。当前，crc的临床治疗主要依赖于手术、放疗和化疗等手段。化疗是目前最常用的抗癌策略之一，近年来，免疫疗法在肿瘤治疗中的地位也在逐渐上升中。临床上已联合免疫调节药物和抗肿瘤药物共同用于治疗炎症相关癌症。然而，由于大多数药物在协同治疗中的溶解度和生物利用度不同，其靶向性差、药物利用率低以及易耐药等缺点往往大幅限制了其应用。
2、一般来说，10-200 nm范围内的纳米载体更有可能通过从高通透性肿瘤血管系统和动态开口被动外渗而积聚在实体瘤中。此外，纳米载体还能够解决难溶性药物的溶解性问题，减少化疗药物在运输过程中的毒副作用，延长其血液循环时间，从而显著提高药物对肿瘤细胞的靶向性和利用率。理想情况下，我们希望纳米药物在正常组织中“失活”，并在肿瘤微环境中特异性地“激活”。因此，除了稳健的稳定性外，理想的纳米载体还应具有响应靶触发物的智能时空控制药物释放功能。考虑到肿瘤中酸性微环境的内源性刺激，ph响应被广泛用于控制药物释放。
3、吉西他滨（gem）作为一种嘧啶类广谱抗癌药物，它对各种癌症（包括结肠癌、肺癌、胰腺癌和卵巢癌）都具有广谱活性。然而，其 8-17 分钟的极短半衰期和快速的代谢失活（通过脱氧胞苷脱氨酶）限制了其治疗效果，因此
4、本工作利用正常细胞和肿瘤细胞微环境之间的ph差异，开发了一种新型的基于ph智能响应的超分子自组装纳米药物。基于天然低聚糖环糊精构建了一种制备简单、结构稳定、药物释放可控且内毒性低的多功能反应性聚前药（pcbg）。通过超分子自组装，pcbg与msa-2实现了吉西他滨和msa-2在肿瘤区域的高效共递送。这一创新策略通过协同激活sting通路，显著增强了抗肿瘤免疫治疗的效果，提高了结肠癌的治疗效果，并有效减少了毒副作用，为crc的治疗开辟了新的道路。
技术实现思路
1、本工作通过研究构建了一种简单安全且有效的超分子纳米药物，通过环糊精负载sting抑制剂msa-2，以实现肿瘤生长抑制和增强抗肿瘤免疫。研究在肿瘤酸性环境下，高分子前药的基本表征、药物释放、细胞吞噬、细胞毒性等，旨在提供一种ph响应型多臂聚前药的制备方法，为构建有效的结肠癌治疗靶向递送系统提供了新的思路。
2、本专利技术的技术方案具体如下：
3、一种ph响应型多臂聚前药纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4、（1）将一定量的mpeg5000-nhs, 单（6-氨基-6-脱氧）-β-环糊精（β-cd-nh2）完全溶解在3 ml 的无水n,n-二甲基甲酰胺（dmf）中后，再滴加一定量的三乙胺（tea）至体系中并于25℃下反应48 h，反应结束后通过乙醚沉淀收集得到mpeg-cd。
5、（2）将一定量mpeg-cd, 对羧基苯甲醛（4-cba）和4-（二甲基氨基）吡啶（dmap）溶解在3 ml 的无水dmf中后，冰浴条件下滴加n,n’-二环己基碳二亚胺（dcc），然后在25℃下反应24 h,反应结束后通过乙醚沉淀收集得到mpeg-cd-cba。
6、（3）将一定量mpeg-cd-cba和吉西他滨（gem）溶解在3 ml的无水dmf中并于50℃下反应24 h,反应结束后通过乙醚沉淀收集得到pcbg。
7、（4）将一定量pcbg和msa-2完全溶解在0.1 ml的dmso中后，在搅拌条件下将混合液缓慢滴加至1 ml二次水中，持续搅拌6 h后，将混合物转移到透析袋（mw = 3500 da）用二次水透析24 h即获得pcgm nps。
8、进一步的，步骤（1）中，mpeg5000-nhs溶液的摩尔浓度范围为0.02~0.07 mol·l-1；β-cd-nh2溶液的摩尔浓度范围为0.02~0.08 mol·l-1；三乙胺的体积620-660 μl；洗涤产物过程中，产物与乙醚的体积比范围为1:1~1:2。
9、进一步的，步骤（2）中，mpeg-cd的质量浓度范围为45~55 mg·ml-1；4-cba的摩尔浓度范围为0.1~0.2 mol· l-1; dmap与dcc摩尔比为1:3且dmap摩尔浓度范围为0.02~0.05mol·l-1; 洗涤产物过程中，产物与乙醚的体积比范围为1:1~1:2。
10、进一步的，步骤（3）中，mpeg-cd-cba的质量浓度范围为5~20 mg·ml-1；gem的摩尔浓度范围为0.005~0.02 mol·l-1; 洗涤产物过程中，产物与乙醚的体积比范围为1:1~1:2。
11、进一步的，步骤（4）中，pcbg溶于dmso中得到的质量浓度范围为50~200 mg·ml-1；混合溶液的质量浓度范围为5~20 mg·ml-1；透析过程中胶束与去离子水的体积比例范围为1:200~1:300。
12、本专利技术的主要优点在于：
13、本工作通过研究构建了一种简单安全且有效的超分子纳米药物，通过环糊精负载sting抑制剂msa-2，以实现肿瘤生长抑制和增强抗肿瘤免疫。pcgm nps平均粒径小且分布均匀，并具有较强的负电荷，有助于其在生物体内稳定存在并实现高效递送。
14、体外释放模拟实验证明pcgm nps具有ph触发的肿瘤微环境靶向持续释放特性，确保药物能够在肿瘤部位精准释放，从而提高治疗效果并减少副作用。细胞实验进一步验证了pcgm nps对ct26细胞的毒性作用及免疫增强能力，显示出其在肿瘤治疗中的巨大潜力。
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1.一种pH响应型多臂聚前药纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.（2）将一定量mPEG-CD, 对羧基苯甲醛（4-CBA）和4-（二甲基氨基）吡啶（DMAP）溶解在3 mL的无水DMF中后，冰浴条件下滴加N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC），然后在25℃下反应24h,反应结束后通过乙醚沉淀收集得到mPEG-CD-CBA。
3.（3）将一定量mPEG-CD-CBA和吉西他滨（GEM）溶解在3 mL的无水DMF中并于50℃下反应24 h,反应结束后通过乙醚沉淀收集得到PCBG。
4.（4）将一定量PCBG和MSA-2完全溶解在DMSO中后，在搅拌条件下将混合液缓慢滴加至1 mL 二次水中，持续搅拌6 h后，将混合物转移到透析袋（MW = 3500 Da）用二次水透析24h即获得PCGM NPs。
5.根据权利要求1所述的一种pH响应型多臂聚前药纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，mPEG5000-NHS溶液的摩尔浓度范围为0.02~0.07 mol·L-1；β-CD-NH2溶液的摩尔浓度范围为0.02~0.
6.根据权利要求1所述的一种pH响应型多臂聚前药纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，mPEG-CD的质量浓度范围为45~55 mg·mL-1；4-CBA的摩尔浓度范围为0.1~0.2 mol·L-1；DMAP与DCC摩尔比为1:3且DMAP摩尔浓度范围为0.02~0.05 mol· L-1; 洗涤产物过程中，产物与乙醚的体积比范围为1:1~1:2。
7.根据权利要求1所述的一种pH响应型多臂聚前药纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，mPEG-CD-CBA的质量浓度范围为5~20 mg·mL-1；GEM的摩尔浓度范围为0.005~0.02 mol·L-1; 洗涤产物过程中，产物与乙醚的体积比范围为1:1~1:2。
8.根据权利要求1所述的一种pH响应型多臂聚前药纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中，PCBG溶于DMSO中得到的质量浓度范围为50~200 mg·mL-1；混合溶液的质量浓度范围为5~20 mg·mL-1；透析过程中胶束与去离子水的体积比例范围为1:200~1:300。
...【技术特征摘要】
1.一种ph响应型多臂聚前药纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.（2）将一定量mpeg-cd, 对羧基苯甲醛（4-cba）和4-（二甲基氨基）吡啶（dmap）溶解在3 ml的无水dmf中后，冰浴条件下滴加n,n’-二环己基碳二亚胺（dcc），然后在25℃下反应24h,反应结束后通过乙醚沉淀收集得到mpeg-cd-cba。
3.（3）将一定量mpeg-cd-cba和吉西他滨（gem）溶解在3 ml的无水dmf中并于50℃下反应24 h,反应结束后通过乙醚沉淀收集得到pcbg。
4.（4）将一定量pcbg和msa-2完全溶解在dmso中后，在搅拌条件下将混合液缓慢滴加至1 ml 二次水中，持续搅拌6 h后，将混合物转移到透析袋（mw = 3500 da）用二次水透析24h即获得pcgm nps。
5.根据权利要求1所述的一种ph响应型多臂聚前药纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，mpeg5000-nhs溶液的摩尔浓度范围为0.02~0.07 mol·l-1；β-cd-nh2溶液的摩尔浓度范围为0.02~0.08 mol·l-1；三乙胺的体积620-6...
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