【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及珍贵中药材病害防治领域，特别是涉及一种西红花球茎腐烂病菌尖孢镰刀菌的检测技术。
技术介绍
1、西红花(crocus sativus l.)，又称番红花、藏红花，为鸢尾科多年生草本植物，原产于地中海沿岸西班牙、希腊和伊朗等地，明朝传入中国，在上海、浙江等地引种栽培成功。其深红色的柱头不仅有很高的药用价值，而且许多国家将其柱头中特有的天然色素和芳香物质作为香料应用，极具开发价值，成为世界上公认的“最昂贵的香料”，也被称为“植物黄金”。柱头是西红花的主要药用部分，能够提高人体免疫力，具有一定抗癌活性。我国传统医学认为西红花味甘、性平，入心、肝经，具有凉血解毒、活血化瘀、散郁开结等功效[2-4]，能活血通脉、养血祛疲、消肿止痛，可用于治疗产后疲阻、温毒发斑、忧郁痞闷、忧思郁结、惊悸恍惚、胸膈癌闷、妇女闭经、跌扑肿痛等病症，是传统妇科、伤科良药。近期研究表明，西红花干燥柱头中含有藏红花酸，具有抑制肿瘤细胞生长和增殖的作用，对帕金森综合症有治疗和预防作用。西红花集多种用途于一身，在国内外需求量极大。国际市场价格高。我国目前西红花年产量仅约仅能满足全球市场需求的20％左右。因此，西红花也是目前紧缺的名贵药材之一，被国家中医药管理局列为重点发展的中药材品种。导致西红花产量无法显著提高的一个中药原因是植物病害，尤其是西红花球茎腐烂病。
2、在西红花主产区浙江省建德市，随着种植面积的增大及多年的无性繁殖，当地西红花球茎腐烂病等病害越发严重，每年发病面积达种植面积的30％-50％，造成球茎腐烂，叶徒长变黄，最后枯死，严重影响
3、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)属于一个复合种，它里面包括非致病性和致病性菌株。非致病性尖孢镰刀菌通常以腐生菌的形式存在于土壤中，其中一些已被鉴定为生防菌和内生菌。尖孢镰刀菌复合种的遗传异质性和缺乏可靠的形态学特征，意味着区分致病性和非致病性菌株以及不同的镰刀菌之间一直是具有挑战性的国际难题，并且前期的大多数研究依赖于对不同宿主植物的致病性试验。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种西红花球茎腐烂病菌的检测方法和用途及所用引物。本专利技术研发了西红花球茎腐烂病菌的特异性精准检测技术。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种可特异性鉴定出尖孢镰刀菌西红花专化型菌株的引物对：
3、上游引物：5’-tgcggactctggtgtatc-3’
4、下游引物：5’-tctgaaagcgttgtaatgt-3’。
5、利用上述引物对能对特异six基因对尖孢镰刀菌西红花专化型dna进行扩增。
6、即，本专利技术选取了尖孢镰刀菌西红花专化型中特有的寄主专化性决定因子基因--six基因为靶标。
7、本专利技术还同时提供了一种西红花球茎腐烂病菌尖孢镰刀菌的检测方法，采用上述引物对，包括以下步骤：
8、1)、提取待测西红花球茎的dna；
9、2)、对步骤1)提取的dna进行pcr扩增反应，pcr反应体系总体积50μl：2×taq pcrmaster mix 25μl，上游引物和下游引物各1μl，模板dna 2μl，ddh2o 21μl；
10、3)、six基因pcr反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，51.2℃退火，退火时间30s，72℃延伸，延伸时间30s，35个循环；72℃延伸10min；
11、说明：退火时间根据引物不同而改变，延伸时间根据不同特异性基因长度而改变，见表1。
12、4)、将pcr扩增得到的产物(15μl)加入1％琼脂糖凝胶点样孔中，电压130v电泳25min后，放至凝胶成像仪中查看电泳条带；当能获得275bp条带时，判定待测西红花球茎已经感染了尖孢镰刀菌草莓专化型(f.oxysporum f.sp.fragariae)菌。
13、即，判定试验结果的方法为仅西红花尖孢镰刀菌出现清晰的符合引物长度的条带。
14、本专利技术还同时提供了一种西红花球茎腐烂病的防控方法，在西红花种球种植(常规种植)前，需要按照上述方法先进行西红花球茎腐烂病菌尖孢镰刀菌的检测，当检测结果为已经感染了尖孢镰刀菌草莓专化型(f.oxysporum f.sp.fragariae)菌，需要对西红花种球先进行药物处理，而后再进行种植(常规种植)。从而保证西红花的高产优质。
15、作为本专利技术的西红花球茎腐烂病的防控方法的改进，药物处理为：500g/l氟啶胺悬浮剂(宁波石原金牛农业科技有限公司生产)2000±200倍稀释液，浸西红花种球20±2min后，控干水分。
16、本专利技术中，检测西红花球茎腐烂病病菌的判定试验结果的方法为仅西红花尖孢镰刀菌出现清晰的符合引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可特异性鉴定出尖孢镰刀菌西红花专化型菌株的引物对，其特征在于为：
2.西红花球茎腐烂病菌尖孢镰刀菌的检测方法，其特征在于：采用权利要求1所述的引物对，包括以下步骤：
3.西红花球茎腐烂病的防控方法，其特征是：在西红花种球种植前，需要按照权利要求2所述方法先进行西红花球茎腐烂病菌尖孢镰刀菌的检测，当检测结果为已经感染了尖孢镰刀菌草莓专化型(F.oxysporum f.sp.fragariae)菌，需要对西红花种球先进行药物处理，而后再进行种植。
4.根据权利要求3所述的西红花球茎腐烂病的防控方法，其特征是：药物处理为：500g/L氟啶胺悬浮剂2000±200倍稀释液，浸西红花种球20±2min后，控干水分。
【技术特征摘要】
1.一种可特异性鉴定出尖孢镰刀菌西红花专化型菌株的引物对，其特征在于为：
2.西红花球茎腐烂病菌尖孢镰刀菌的检测方法，其特征在于：采用权利要求1所述的引物对，包括以下步骤：
3.西红花球茎腐烂病的防控方法，其特征是：在西红花种球种植前，需要按照权利要求2所述方法先进行西红花球茎腐烂病菌尖孢镰刀菌的检测，...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘亚慧，赵帅锋，王强，董代幸，张传清，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：
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