【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程，更具体地说，本专利技术涉及一种利用广金钱草碳糖基转移酶合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法。
技术介绍
1、夏佛塔苷和异夏佛塔苷是一对黄酮杂糖双碳苷的同分异构体，这两个化合物广泛分布于高等植物中。据报道，夏佛塔苷和异夏佛塔苷至少存在于39个科，184种植物中，其中真叶植物占82.6％，单子叶植物占15.2％，蕨类植物占1.1％，苔藓植物占1.1％。西番莲科、豆科和菊科数量最多，其次是禾本科和天南星科。
2、小鼠喂食160毫克/千克浓度剂量的广金钱草中的夏佛塔苷，可以显著阻止胆结石形成[liu mj,et al.2017]。近期，研究人员发现，夏佛塔苷能够同时抑制木瓜样蛋白酶(plpro)以及新冠病毒主蛋白酶(3clpro)，从而双靶点抑制新冠病毒；在细胞实验中(veroe6)，夏佛塔苷可以无显著毒性(cc50＞200μm)地抑制新冠病毒，其ec50为11.83μmol/l；并且研究人员利用氢氘交换质谱和量子力学等方法阐明了夏佛塔苷和新冠病毒的结合机制。夏佛塔苷在急性肺炎小鼠模型中具有显著的抗炎活性，可以抑制血浆和肺组织的il-1β、il-6和tnf-α炎症因子，显著缓解了小鼠的肺部损伤；蛋白质组学研究表明夏佛塔苷还表现出免疫调节；根据这些研究结果，说明夏佛塔苷可能治疗新冠病毒感染。山蚂蝗属植物根系所分泌的黄酮杂糖双碳苷类化合物如异夏佛塔苷可以抑制寄生种子胚芽生长，从而有效防治独脚金属寄生杂草对作物的侵害作用[khan zr,et al.2010]。此外，夏佛塔苷和异夏佛塔苷是重要的植物防御化合物，其含
3、2020年，研究人员发现植物体中的(异)夏佛塔苷的生物合成涉及一种以前从未报道的二-c-糖基化途径，即(异)夏佛塔苷的生物合成由两种c-糖基转移酶(cgt)依次催化而成，分别由2-羟基黄烷酮c-糖基转移酶(cgta)催化2-羟基柚皮素c-葡萄糖基化，随后c-葡萄糖-2-羟基黄烷酮c-糖基转移酶(cgtb)发生c-阿拉伯糖基化生成(异)夏佛塔苷[wangzl,et al.2020]。2021年，研究人员通过引入特定的cgta和cgtb(phugt708a43和osugt708a1)，实现了在大肠杆菌中制备(异)夏佛塔苷[chenz,et al.2021]。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术的目的在于提供一种合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，该方法仅需一个碳糖基转移酶cgt即可实现夏佛塔苷或异夏佛塔苷的生物合成。
2、实现上述专利技术目的的技术方案包括如下。
3、本专利技术的第一方面，提供了一种合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，包括以下步骤：使用广金钱草碳糖基转移酶作为催化剂，催化2羟基柚皮素和udp-arabinose进行反应后，再加入udp-glucose继续进行反应；所述广金钱草碳糖基转移酶的氨基酸序列如seq idno:3或seq id no:4所示。
4、本专利技术的第二方面，提供了一种合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，包括以下步骤：使用广金钱草碳糖基转移酶作为催化剂，催化2羟基柚皮素、udp-arabinose和udp-glucose进行反应；所述广金钱草碳糖基转移酶的氨基酸序列如seq id no:3或seq id no:4所示。
5、本专利技术具有以下有益效果：
6、本专利技术的专利技术人在对c-糖基转移酶进行性能分析时发现，c-糖基转移酶gscgt1或gscgt2可以催化2羟基柚皮素和udp-arabinose先发生阿拉伯糖基化生成c-阿拉伯糖-2羟基柚皮素，再与udp-glucose继续葡萄糖基化生成di-c-葡萄糖-阿拉伯糖-2-羟基柚皮素(即发生连续两步碳糖基化)；c-糖基转移酶gscgt1或gscgt2也可以催化2羟基柚皮素与udp-arabinose和udp-glucose直接生成di-c-葡萄糖-阿拉伯糖-2-羟基柚皮素；di-c-葡萄糖-阿拉伯糖-2-羟基柚皮素是夏佛塔苷或异夏佛塔苷的重要前体化合物，经体外盐酸脱水处理后，可以生成夏佛塔苷或异夏佛塔苷。
7、相比现有需要串联使用c-葡萄糖-2-羟基黄烷酮c-糖基转移酶(cgta)和c-阿拉伯糖-2-羟基黄烷酮c-糖基转移酶(cgtb)两种酶催化2羟基柚皮素才能合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，本专利技术只需要使用一种c-糖基转移酶就可以生物合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷，具有降低能耗、环境友好等特点；为未来以微生物(大肠杆菌、酵母)或植物(番茄、烟草)高效率系统生产夏佛塔苷或异夏佛塔苷提供了一种简单可行的方法，从而利于医药、农业和食品工业规模化利用夏佛塔苷或异夏佛塔苷。
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1.一种合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用广金钱草碳糖基转移酶作为催化剂，催化2羟基柚皮素和UDP-Arabinose进行反应后，再加入UDP-glucose继续进行反应；所述广金钱草碳糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4所示。
2.根据权利要求1所述的合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，所述2羟基柚皮素和UDP-Arabinose的摩尔用量比为1：4～6，优选为1：4.5～5.5；和/或，所述2羟基柚皮素和UDP-glucose的摩尔用量比为1：4～6，优选为1：4.5～5.5。
3.根据权利要求2所述的合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，所述2羟基柚皮素与所述广金钱草碳糖基转移酶的用量比为100μM：45～55ug。
4.根据权利要求1所述的合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，所述反应的温度为34～36℃，反应的时间为4～6min。
5.根据权利要求1～4任一项所述的合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，反应结束后，还包括将反应产物进行体外
6.根据权利要求1所述的合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：配制包括广金钱草碳糖基转移酶、2羟基柚皮素、UDP-Arabinose和Na2HPO4-NaH2PO4的反应体系，34～36℃反应4～6min；再加入UDP-glucose继续34～36℃反应4～6min后，甲醇终止反应，将反应产物进行体外盐酸脱水处理；所述广金钱草碳糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示；所述2羟基柚皮素和UDP-Arabinose的摩尔用量比为1：4.5～5.5；所述2羟基柚皮素和UDP-glucose的摩尔用量比为1：4.5～5.5；所述2羟基柚皮素与所述广金钱草碳糖基转移酶的用量比为100μM：45～55ug。
7.一种合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用广金钱草碳糖基转移酶作为催化剂，催化2羟基柚皮素、UDP-Arabinose和UDP-glucose进行反应；所述广金钱草碳糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
8.根据权利要求7所述的合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，所述2羟基柚皮素、UDP-Arabinose和UDP-glucose的摩尔用量比为1：4～6：4～6，优选为1：4.5～5.5：4.5～5.5；和/或，所述反应的温度为34～36℃，反应的时间为8～12min；和/或，所述2羟基柚皮素与所述广金钱草碳糖基转移酶的用量比为100μM：45～55ug。
9.根据权利要求7所述的合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，反应结束后还包括收集反应产物中的C-葡萄糖-C阿拉伯糖-2-羟基柚皮素，再进行体外盐酸脱水处理的步骤。
10.根据权利要求7所述的合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：配制包括广金钱草碳糖基转移酶、2羟基柚皮素、UDP-Arabinose、UDP-glucose和Na2HPO4-NaH2PO4的反应体系，34～36℃反应8～12min，甲醇终止反应，收集反应产物中的C-葡萄糖-C阿拉伯糖-2-羟基柚皮素，进行体外盐酸脱水处理；所述广金钱草碳糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示；所述2羟基柚皮素、UDP-Arabinose和UDP-glucose的摩尔用量比为1：4.5～5.5：4.5～5.5；所述2羟基柚皮素与所述广金钱草碳糖基转移酶的用量比为100μM：45～55ug。
...【技术特征摘要】
1.一种合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用广金钱草碳糖基转移酶作为催化剂，催化2羟基柚皮素和udp-arabinose进行反应后，再加入udp-glucose继续进行反应；所述广金钱草碳糖基转移酶的氨基酸序列如seq id no:3或seq idno:4所示。
2.根据权利要求1所述的合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，所述2羟基柚皮素和udp-arabinose的摩尔用量比为1：4～6，优选为1：4.5～5.5；和/或，所述2羟基柚皮素和udp-glucose的摩尔用量比为1：4～6，优选为1：4.5～5.5。
3.根据权利要求2所述的合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，所述2羟基柚皮素与所述广金钱草碳糖基转移酶的用量比为100μm：45～55ug。
4.根据权利要求1所述的合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，所述反应的温度为34～36℃，反应的时间为4～6min。
5.根据权利要求1～4任一项所述的合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，反应结束后，还包括将反应产物进行体外盐酸脱水处理的步骤。
6.根据权利要求1所述的合成夏佛塔苷或异夏佛塔苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：配制包括广金钱草碳糖基转移酶、2羟基柚皮素、udp-arabinose和na2hpo4-nah2po4的反应体系，34～36℃反应4～6min；再加入udp-glucose继续34～36℃反应4～6min后，甲醇终止反应，将反应产物进行体外盐酸脱水处理；所述广金钱草碳糖基转移酶的氨基酸序列如seq id no:3或seq id no:4所示；所述2羟基柚皮素和udp-arabinose的摩尔用量比为1：4.5～5.5；所述2羟基柚皮素和udp-glucose的摩尔用量比为1：4...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾少华，王瑛，史丁丁，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：
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