【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种缺失二十四个基因的减毒非洲猪瘟病毒株asfv-δmgf100的构建及其作为疫苗的应用。
技术介绍
1、非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus,asfv)引起的一种高发病率、高死亡率的烈性传染病，野猪和家猪均是易感动物，强毒株可引起家猪的死亡率高达100％，asf为世界动物卫生组织(oie)法定上报的疫病之一，我国将其列为一类传染病。asfv是非洲猪瘟病毒属(asfarviridae)的唯一成员，也是唯一可以通过节肢动物传播的dna病毒(虫媒病毒，arbovirus)。asfv是一种多层结构包裹的双链dna病毒，直径约为200nm，病毒粒子最内部的病毒核酸由核心衣壳(core shell)包裹，同时核心衣壳由内膜(inner membrane)(又称内脂膜，inner lipid envelope)包裹，在内膜外是二十面体结构的蛋白衣壳(capsid)，病毒最外层由一层质膜包裹(plasma membrane)。其中p72是构成衣壳主要蛋白(由b646l基因编码，由pp220和pp62衍生而来)，约占衣壳蛋白总量的33％。p72基因序列是asfv基因型分型的依据，p72也是asfv诊断的主要抗原，多种检测试剂是依据p72蛋白信息开发的，并且研究发现其单克隆抗体具有中和asfv的能力。
2、非洲猪瘟造成了难以估量的经济损失，采取疫苗防控是清除非洲猪瘟最有效的手段。目前国内外的研究中，针对非洲猪瘟的疫苗
3、本研究拟运用基因工程技术，通过敲除asfv的毒力基因或参与干扰宿主免疫的基因后形成减毒弱毒株，毒力更稳定，毒力返强的可能性也更小，具有更高的安全性。此类疫苗已有多篇文章报道。
4、研究证明，vivian o'donnell等人在2007年格鲁吉亚asfv(asfv-g)基因组中敲除了b119l和dp96r基因，构建了asfv-g-δ9gl/δuk毒株，该毒株免疫14天后可为猪群提供100％的保护，但会存在病毒血症，研究还证实了保护作用的产生与血清中asfv抗体存在有关，与特异性ifn-γ分泌的细胞无关。i267l基因在asfv的复制中发挥重要作用，通过抑制rna pol-iii-rig-i介导的先天性抗病毒免疫反应，来促进病毒的复制，而ran yong等人构建了asfv-δi267l基因缺失毒(缺失i267l基因)，进行动物实验评价后发现该缺失毒可提供针对亲本的80％保护率。manuel v borca等人发现ep402r基因可编码asfv的跨膜蛋白，从而参与宿主的免疫调节，实验还证明了缺失ep402r基因后，该缺失毒不能提供任何的保护率。
5、在非洲猪瘟的基因组中还存在着一类特殊的基因——多基因家族(multi-genesfamily,mgf)，已知不同基因型的asfv中共包含5类mgf，分别为mgf100(1r/2l/3l)、mgf110(1l/2l/3l/4l/5l/6l/7l/8l/9l/10l/11l/12l/13l/14l)、mgf300(1l/2r/3l/4l)、mgf360(1l/2l/3l/4l/5l/6l/7l/8l/9l/10l/11l/12l/13l/14l/15r/16r/17r/18r/19r/20r/21r/22r)和mgf505(1r/2r/3r/4r/5r/6r/7r/8r/9r/10r/11l)。研究报道，mgfs在病毒毒力、调控干扰素应答和炎症反应方面具有重要作用。因此，通过构建mgf基因缺失病毒的研究也十分丰富。
6、同时缺失mgf360-9l、mgf360-10l、mgf360-11l、mgf360-12l、mgf360-13l、mgf360-14l、mgf505-1r、mgf505-2r、mgf505-3r和mgf505-4r后的重组病毒在细胞水平上的复制速率与亲本病毒benin97/1和ourt88/3相似，免疫后可以诱导产生大量的ifn-β，攻毒后可以保护机体免受同源或异源毒株的攻击，保护率高达100％。在另一项研究中证实，同时缺失mgf360-9l和mgf505-7r所构建的缺失毒，免疫后的保护率为80％。但并不是所有的缺失毒都有良好的保护效果，研究发现，缺失mgf110-1l后病毒的复制速率以及临床症状和亲本病毒相似，证明该基因与病毒毒力无关。缺失mgf360和mgf505以及cd2v的重组病毒(asfv-g-δ9gl/δmgf)可以作为非洲猪瘟的候选疫苗，该缺失毒株免疫后，猪的存活率为100％，且在免疫后没有检测到病毒血症和asfv特异性抗体，但该毒株并不能提供保护作用在asfv-g中同时缺失mgf110-5l和mgf110-6l后，病毒的复制没有变化，并且免疫后不能提供同源保护。在tomoya kitamura等人发现的自然重组毒中发现缺失了11个基因(mgf300-4l,mgf360-8l,mgf360-9l,mgf360-10l,mgf360-11l,mgf505-1r,mgf360-12l,mgf360-13l,mgf360-14l,mgf505-2r和mgf505-3r)，该缺失毒可提供针对亲本毒株攻击的100％保护。
7、针对上述，本专利技术通过联合缺失mgf-100-1r基因、mgf-100-2l基因和mgf-100-3l基因，获得了一株安全性较好的减毒非洲猪瘟病毒株；肌肉注射高剂量所述减毒非洲猪瘟病毒株(每头猪免疫106had50)猪仍不发病，说明该毒株肌肉注射不能够致猪发病死亡；而且免疫猪后，猪血清里检测到低病毒，安全性良好；攻毒实验表明，所述减毒非洲猪瘟病毒株能对asfv cn/gs/2018分离的强株攻毒具有80％免疫保护，因此，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本专利技术提供一种构建减毒非洲猪瘟病毒株的策略，所述策略为：联合缺失亲本毒株中mgf-100-1r基因、mgf-100-2l基因和mgf-100-3l基因。其中，由于mgf-100-2l和mgf-100-3l为相邻的2个基因，因此可以用一个同源重组打靶载体将p72-mcherry本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.通过在II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018中联合缺失基因片段制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用，其特征在于，所述基因片段包括MGF-100-1R基因的全部/部分核苷酸序列、MGF-100-2L基因的全部/部分核苷酸序列和MGF-100-3L基因的全部/部分核苷酸序列；所述II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202096。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缺失的基因片段为II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018全长序列的第11094-11468位、第179519-179944位和第180309-180617位。
3.通过在II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018中联合缺失基因片段制备非洲猪瘟疫苗的应用，其特征在于，所述基因片段包括MGF-100-1R基因的全部/部分核苷酸序列、MGF-100-2L基因的全部/部分核苷酸序列和MGF-100-3L基因的全部/部分核苷酸序列；所述II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018保藏于中国典型培养物保藏中
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述缺失的基因片段为II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018全长序列的11094-11468位、第179519-179944位和第180309-180617位。
5.一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株为基因片段缺失的II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018；所述基因片段包括MGF-100-1R基因的全部/部分核苷酸序列、MGF-100-2L基因的全部/部分核苷酸序列和MGF-100-3L基因的全部/部分核苷酸序列；所述II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202096。
6.如权利要求5所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述缺失的基因片段为II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018全长序列的11094-11468位、第179519-179944位和第180309-180617位。
7.一种非洲猪瘟疫苗，其特征在于，所述非洲猪瘟疫苗包括权利要求5或6所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株。
8.一种制备权利要求5或6所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的方法，其特征在于，所述的方法是通过基因工程手段将原始II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018中MGF-100-1R基因的全部/部分核苷酸序列、MGF-100-2L基因的全部/部分核苷酸序列和MGF-100-3L基因的全部/部分核苷酸序列。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法为同源重组技术。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.通过在ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs2018中联合缺失基因片段制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用，其特征在于，所述基因片段包括mgf-100-1r基因的全部/部分核苷酸序列、mgf-100-2l基因的全部/部分核苷酸序列和mgf-100-3l基因的全部/部分核苷酸序列；所述ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：v202096。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缺失的基因片段为ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs 2018全长序列的第11094-11468位、第179519-179944位和第180309-180617位。
3.通过在ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs2018中联合缺失基因片段制备非洲猪瘟疫苗的应用，其特征在于，所述基因片段包括mgf-100-1r基因的全部/部分核苷酸序列、mgf-100-2l基因的全部/部分核苷酸序列和mgf-100-3l基因的全部/部分核苷酸序列；所述ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：v202096。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述缺失的基因片段为ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs 2018全长序列的11094-11468位、第179519-179944位和第180309-180617位。
...【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，党文，许凡，丁明洋，李涛，杜煜，刘华南，石正旺，田宏，朱紫祥，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心，
类型：发明
国别省市：
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