【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药材鉴定，尤其涉及一种用于鉴定黄精、滇黄精和多花黄精的indel引物及鉴定方法。
技术介绍
1、以植物、动物来源的中药材在生物学上物种的确定，称为基源。如果中药材的标准来源项下收载有两个及以上基原的情况称之为多基原中药材。尽管多基原中药材缓解了中药材市场空缺，然而多基原的混合使用严重影响重要临床疗效的有效性、安全性与质量可控性。为此，国家食品药品监督管理总局于2016年颁布《中药配方颗粒管理办法(征求意见稿)》规定：“对栽培、养殖或野生采集的药用动植物，应准确鉴定其物种，包括亚种、变种和品种，不同种的中药材不可相互混用”。
2、2020年版药典记载，中药材黄精为百合科植物滇黄精(polygonatum kingianumcoll.et hemsl.)、黄精(polygonatum sibiricum red.)或多花黄精(polygonatumcyrtonema hua)的干燥根茎，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾的功能，用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳，劳嗽咳血，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴。三种基原黄精因其基原不同，导致功效成分含量上存在差异，使其药效存在区别，从而威胁到用药安全和疗效，因此对其进行准确、快速的鉴定，是从基原保证黄精药材质量控制的关键。
3、黄精属植物具有较高的形态多样性，自然野生状态下，不同种间、同种不同居群个体间的形态特征常存在过渡类型，且种间地理分布交叉重叠，导致依据形态性状不易对不同物种进行准确区分鉴定，特别是经过炮制后，更是难以对药材
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提出了一种用于鉴定黄精、滇黄精、多花黄精的indel引物及鉴定方法，旨在提高对黄精、滇黄精、多花黄精的鉴定速度。
2、第一方面，本专利技术提供了一种用于鉴定黄精、滇黄精和多花黄精的indel引物，包括4组indel引物，其核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.4所示。
3、以上实施方式中，引物组合基于滇黄精、黄精和多花黄精叶绿体基因组序列，通过对比分析发现2个较长的indel标记，其中一个标记位于叶绿体基因组lsc区的trnf-gaa基因后的261bp处，黄精、多花黄精为：
4、“tcatatcatatatatcaaaaaaatgcagttgtctaaaactaaaaaac ttctaagtttattttataggagttgaaggataggaaaagacagg”；
5、而滇黄精完全缺失此段序列，在序列两端设计dhj正反引物；另一个标记位于叶绿体基因组lsc区的rps16基因后的330bp处，其中滇黄精为：
6、“tcgttttttgttttcgtgagtatggaatagaagagtgtcagataaaa gtcgtt”；
7、而黄精、多花黄精完全缺失此段序列，在序列两端设计hj正反引物，从而获得引物信息。
8、第二方面，本专利技术还提供一种上述indel引物在黄精、滇黄精和多花黄精的鉴定中的应用。
9、第三方面，本专利技术还提供一种试剂盒，该试剂盒包括上述用于鉴定黄精、滇黄精和多花黄精的indel引物。
10、第四方面，本专利技术还提供一种上述试剂盒在黄精、滇黄精和多花黄精的鉴定中的应用。
11、第五方面，本专利技术还提供一种黄精、滇黄精、多花黄精的鉴定方法，该方法包括如下步骤：
12、步骤一、提取待测样品的dna；
13、步骤二、以待测样品的dna作为模板，利用权利要求1所述的indel引物进行pcr扩增；
14、步骤三、通过电泳对扩增产物进行检测，根据目标条带的大小，与黄精、滇黄精和多花黄精的标准图谱对照，区分鉴别黄精、滇黄精和多花黄精基源。
15、在一些实施方式中，步骤二中，50μl pcr的反应体系包括：premix 25μl，上、下游引物各1μl，dna模板1μl，加灭菌双蒸水至50μl。
16、在一些实施方式中，步骤二中，pcr的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃保温5min。
17、在一些实施方式中，当步骤二所采用引物核苷酸序列为seq id no.1～seq idno.2时，滇黄精的标准图谱中pcr扩增产物大小为152bp；当步骤二所采用引物核苷酸序列为seq id no.3～seq id no.4时，滇黄精的标准图谱中pcr扩增产物大小为227bp。
18、在一些实施方式中，当步骤二所采用引物核苷酸序列为seq id no.1～seq idno.2时，黄精的标准图谱中pcr扩增产物大小为243bp；当步骤二所采用引物核苷酸序列为seq id no.3～seq id no.4时，黄精的标准图谱中pcr扩增产物大小为153bp。
19、在一些实施方式中，当步骤二所采用引物核苷酸序列为seq id no.1～seq idno.2时，多花黄精的标准图谱中pcr扩增产物大小为243bp；当步骤二所采用引物核苷酸序列为seq id no.3～seq id no.4时，多花黄精的标准图谱中pcr扩增产物大小为227bp。
20、以上实施方式中，滇黄精的标准图谱是通过上述核苷酸序列为seq id no.1～seqid no.4的引物经过pcr扩增和电泳后得到，其中，按照seq id no.1～seq id no.2引物扩增滇黄精、黄精和多花黄精的pcr产物大小分别为152bp、243bp、243bp；按照seq id no.3～seq id no.4引物扩增滇黄精、黄精和多花黄精的pcr产物大小分别为227bp、153bp、227bp。
21、上述步骤三中，区分鉴别黄精、滇黄精和多花黄精基源的方法包括：
22、以seq id no.1～seq id no.2引物进行pcr扩增，当样品pcr产物大小为152bp，其电泳条带与滇黄精基原植物电泳条带齐平时，则认定其基原为滇黄精；
23、以seq id no.3～seq id no.4引物进行pcr扩增，当样品pcr产物大小为153bp，其电泳条带与黄精基原植物电泳条带齐平时，则认定其基原为黄精；
24、以seq id no.1～seq id no.2引物进行pcr扩增，当样品pcr产物大小为243bp，其电泳条带与黄精基原植物电泳条带齐平，且以seq id no.3～seq id no.4引物进行pcr扩增，当样品pcr产物大小为227bp，其电泳条带与滇黄精基原植物电泳条带齐平时，则认定其基原为多花黄精。
25、本专利技术相对于现有技术具有以下有益效果：
26、本专利技术建立了一种基于indel引物标记的黄精基原鉴定方法，可以在一天之内实现对滇黄精、黄精和多花黄精基原的鉴定，该方法操作简单，检测周期短，特异性强，具有很高的可行性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鉴定黄精、滇黄精和多花黄精的InDel引物，其特征在于，包括4组InDel引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示。
2.如权利要求1所述的的InDel引物在黄精、滇黄精和多花黄精的鉴定中的应用。
3.一种含有权利要求1所述的InDel引物的试剂盒。
4.如权利要求3所述的试剂盒在黄精、滇黄精和多花黄精的鉴定中的应用。
5.一种黄精、滇黄精和多花黄精的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.如权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，步骤二中，PCR的反应体系包括：Premix25μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，加灭菌双蒸水至50μL。
7.如权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，步骤二中，PCR的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃保温5min。
8.如权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，当步骤二所采用引物核苷酸序列为SEQID No.1～SEQ ID No.2时，滇
9.如权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，当步骤二所采用引物核苷酸序列为SEQID No.1～SEQ ID No.2时，黄精的标准图谱中PCR扩增产物大小为243bp；当步骤二所采用引物核苷酸序列为SEQ ID No.3～SEQ ID No.4时，黄精的标准图谱中PCR扩增产物大小为153bp。
10.如权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，当步骤二所采用引物核苷酸序列为SEQID No.1～SEQ ID No.2时，多花黄精的标准图谱中PCR扩增产物大小为243bp；当步骤二所采用引物核苷酸序列为SEQ ID No.3～SEQ ID No.4时，多花黄精的标准图谱中PCR扩增产物大小为227bp。
...【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定黄精、滇黄精和多花黄精的indel引物，其特征在于，包括4组indel引物，其核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.4所示。
2.如权利要求1所述的的indel引物在黄精、滇黄精和多花黄精的鉴定中的应用。
3.一种含有权利要求1所述的indel引物的试剂盒。
4.如权利要求3所述的试剂盒在黄精、滇黄精和多花黄精的鉴定中的应用。
5.一种黄精、滇黄精和多花黄精的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.如权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，步骤二中，pcr的反应体系包括：premix25μl，上、下游引物各1μl，dna模板1μl，加灭菌双蒸水至50μl。
7.如权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，步骤二中，pcr的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃保温5min。
8.如权利要求5所述的鉴定方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴健，贺友安，王喆，杨强，陈建军，程杨洋，湛文轩，段星昱，赵凡，
申请(专利权)人：劲牌有限公司，
类型：发明
国别省市：
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