【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及癌症标志物检测，具体而言，涉及一种检测癌症标志物ctdna的荧光探针tpe-dna及其制备方法和检测方法。
技术介绍
1、循环肿瘤dna(circulating tumourdna，ctdna)是一种在人体外周血等体液中的肿瘤特异性基因片段。研究表明，ctdna与其他肿瘤生物标志物相比，有更好的特异性、稳定性和更早检测肿瘤的能力。ctdna检测仍存在一些困难。例如，外周血中ctdna的含量变化范围大，有低至0.01％的，还有高至90％的。ctdna还需要捕获和富集，对检测过程增加了难度。传统的pcr和测序技术对检测仪器和检测试剂依赖强、成本高。
2、应变促进的叠氮-烷基环化(spaac)反应是新型的无铜点击化学反应，利用二苯环辛烯(dibo)和叠氮基反应，可在生理条件下进行，克服了催化剂生物毒性，高效稳定。近年来，spaac反应也被用于构建生物传感器，但对于核酸检测来说，基于spaac的aie荧光生物传感器用于dna或rna检测，特别是用于ctdna的检测是还很罕见。
3、因此，急需提供一种新的探针和检测方法来解决ctdna检测困难的问题。
技术实现思路
1、鉴于此，本专利技术提出一种检测癌症标志物ctdna的荧光探针tpe-dna及其制备方法和检测方法，通过将dbco功能化的dna和叠氮功能化的tpe通过spaac连接成探针可以连接不同发射波长的aie分子到dna探针上，具有通用性和灵活性。
2、本专利技术提供了一种检测癌症标志物
3、本专利技术还提供了所述的检测癌症标志物ctdna的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
4、将dbco功能化的dna和叠氮功能化的tpe混合孵育得到所述的检测癌症标志物ctdna的荧光探针tpe-dna。
5、作为优选，所述dbco功能化的dna为3'端标记了dbco的探针1和5'端标记了dbco的探针2；
6、所述探针1的核苷酸序列为agtgattt，所述探针2的核苷酸序列为taga gag。
7、作为优选，所述dbco功能化的dna的浓度为80～120μm，所述dbco功能化的dna的用量为40～60μl。
8、作为优选，所述叠氮功能化的tpe的浓度为0.2～2mm，所述叠氮功能化的tpe的用量为40～60μl。
9、作为优选，dbco功能化的dna和叠氮功能化的tpe混合比例为1:1，所述孵育时间为1～12h。
10、本专利技术还提供了一种利用所述的检测癌症标志物ctdna的荧光探针tpe-dna对癌症标志物ctdna进行检测的方法，包括以下步骤：
11、将荧光探针tpe-dna用pbs稀释后和癌症标志物ctdna混合孵育检测溶液荧光强度。
12、作为优选，所述荧光探针tpe-dna的终浓度为1μm，所述癌症标志物ctdna的浓度为100pm～1μm。
13、作为优选，所述荧光探针tpe-dna和癌症标志物ctdna的混合比例为9：1，所述孵育时间为10min。
14、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
15、本专利技术提供了一种基于aie的荧光检测方法，并用于癌症标志物ctdna的快速检测。利用tpe-n3分子的aie特性的和无铜点击化学反应(spaac)，提出了一种基于aie双探针的荧光开启式检测方法。tpe-dna探针是通过叠氮功能化的tpe(tpe-n3)和环形炔基dbco标记的dna的spaac反应构建的。分别在3'和5'端耦合了tpe分子的双探针本身处于荧光关闭状态。当双探针和目标dna通过碱基互补配对的同时，双链的刚性结构和tpe分子的堆叠聚集引起tpe分子转换到荧光开启状态。双探针荧光开启式检测方案简化了反应过程，检测过程无需酶催化和纳米材料辅助，检测限为39pm，检测时间为10分钟。通过检测肿瘤标记物ctdna，验证了检测方法在核酸快速检测方面的应用潜力。此外，利用spaac可将不同种发射波长的aie分子连接到探针上，有望实现多信号或多位点检测。为核酸的简单直接检测提供了策略。主要效果有：
16、(1)应用新型的无铜点击反应(spaac)构建探针，在溶液中将tpe-n3连接到dna探针。spaac比传统的铜催化点击反应更加简单高效，生物相容性好，适合液态下的检测，具有通用性。
17、(2)提出aie双探针荧光开启式检测方法，检测过程无需纳米淬灭剂或酶的辅助。双探针的荧光开启模式比单探针模式或荧光关闭模式更灵敏可靠，而且克服了传统荧光分子聚集淬灭的问题。
18、(3)将基于aie的荧光检测技术应用在肿瘤标志物ctdna检测中，检测过程简单快捷，可以在10分钟内完成检测，检测限为39pm。为癌症相关的核酸快速筛查提供参考。
19、通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。
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1.一种检测癌症标志物ctDNA的荧光探针TPE-DNA，其特征在于，由DBCO功能化的DNA和叠氮功能化的TPE通过SPAAC连接而成。
2.权利要求1所述的检测癌症标志物ctDNA的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述DBCO功能化的DNA为3'端标记了DBCO的探针1和5'端标记了DBCO的探针2；
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述DBCO功能化的DNA的浓度为80～120μM，所述DBCO功能化的DNA的用量为40～60μL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述叠氮功能化的TPE的浓度为0.2～2mM，所述叠氮功能化的TPE的用量为40～60μL。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，DBCO功能化的DNA和叠氮功能化的TPE混合比例为1:1，所述孵育时间为1～12h。
7.一种利用权利要求1所述的检测癌症标志物ctDNA的荧光探针TPE-DNA对癌症标志物ctDNA进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述荧光探针TPE-DNA的终浓度为1μM，所述癌症标志物ctDNA的浓度为100pM～1μM。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述荧光探针TPE-DNA和癌症标志物ctDNA的混合比例为9：1，所述孵育时间为10min。
...【技术特征摘要】
1.一种检测癌症标志物ctdna的荧光探针tpe-dna，其特征在于，由dbco功能化的dna和叠氮功能化的tpe通过spaac连接而成。
2.权利要求1所述的检测癌症标志物ctdna的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述dbco功能化的dna为3'端标记了dbco的探针1和5'端标记了dbco的探针2；
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述dbco功能化的dna的浓度为80～120μm，所述dbco功能化的dna的用量为40～60μl。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述叠氮功能化的tpe的浓度为0.2～2mm，所述叠氮功能化的tpe的用量为40～60μl。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴郁，吴章鑫，刘忠宇，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：
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