【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分子检测，具体涉及一种铜掺杂普鲁士蓝纳米酶及其制备方法和应用。
技术介绍
1、过氧化氢(h2o2)作为细胞生长代谢过程的中间体，在细胞信号传导、细胞呼吸、免疫调节、血液循环等方面起着重要作用。抗坏血酸(aa)，又名维生素c，是一种具有极强抗氧化性和还原性质的水溶性维生素。抗坏血酸不能由人体合成，只能外部摄入，在维持各种健康决定物质(包括胶原蛋白、肉碱和神经递质)方面发挥着至关重要的作用。当人体中抗坏血酸和过氧化氢浓度过高或过低时，会诱发一系列生理疾病，如腹泻、恶心、皮疹、坏血病、心率不齐等。因此在食品、饮料、医药、环境、生物体液等领域，及时、准确、定量地检测过氧化氢和抗坏血酸的浓度或含量是很有必要的。
2、目前用于检测过氧化氢和抗坏血酸的常用方法有色谱法、毛细管电泳、电化学传感检测法、纳米材料模拟酶比色法等。色谱法依据不同物质在固定相和流动相上的分配系数不同，使得混合物中各物质以不同速率沿固定相移动，从而实现对不同物质的分离。毛细管电泳法是一种液相分析分离手段，通过具有弹性特点的毛细管以及高压直流电的驱动，使待测物质根据其特性差异实现分离和检测。电化学传感检测法，通过所选敏感元件(如酶、抗原、抗体等)与相应待测物质发生反应，电极将反应信号转换成便于提取的电信号，根据待测物质浓度与提取信号间存在的关系，实现对待测物质的检测。纳米材料模拟酶比色法，通过纳米酶模拟过氧化物酶活性，催化过氧化氢分解产生羟基自由基(·oh)氧化显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)，生成氧化产物oxtmb，进一步运
3、纳米酶是一种结构稳定性高、催化活性可调、功能多样性、可循环利用、可大规模制备的类酶活性纳米材料，主要有铁基纳米酶、贵金属纳米酶、有机纳米酶、混合纳米酶等。其中铁基纳米酶分为铁基金属纳米酶(如fe-co nps、feni3)、铁基氧化物纳米酶(如α/β/γ-fe2o3、fe3o4)、铁基硫化物纳米酶(如fes2、fe3s4)、铁基有机框架纳米酶(如fe-mof、普鲁士蓝纳米酶pbnz)。其中铁基有机框架纳米酶具有优异的化学和结构稳定性、价格低廉、毒性低，并且由于mof材料较大的比表面积和丰富的孔道结构，使其能提供丰富的活性位点和催化中心。
4、普鲁士蓝纳米酶(pbnz)因其具有多种酶样特性，包括过氧化氢酶(cat)、过氧化物酶(pod)和超氧化物歧化酶(sod)活性。作为一种功能性纳米材料模拟酶，pbnz不仅克服了天然酶的不稳定性和高制造成本等限制，而且还表现出优异的稳定性、可调的活性、低的存储费用和显着的可重复使用性。然而由于普鲁士蓝初始阶段产生的初生核之间存在定向附着的趋势，尺寸小于50nm的难以合成。同时，由于普鲁士蓝依赖fe3+/fe2+产生类酶活性，存在应用ph窄(3-4)的问题。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种铜掺杂普鲁士蓝纳米酶及其制备方法和应用。本专利技术通过使用乙醇/水混合物作为溶剂和pvp作为表面封端剂，调控成核过程，可以合成粒径小于50nm，平均粒径25nm左右的铜掺杂普鲁士蓝纳米酶；通过合成阶段，引入cu2+可以拓宽铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的可应用ph范围。
2、为实现上述目的，本专利技术通过下述技术方案实现：
3、本专利技术提供一种铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的制备方法，包括：
4、将三价铁盐溶于盐酸中制成铁源溶液；
5、将二价铜盐溶于盐酸中制成铜源溶液；
6、在铁源溶液中先添加表面封端剂溶液，进行一阶段加热反应，待温度从室温升至第一预设温度值时再添加铜源溶液，进行二阶段加热反应，待温度从第一预设温度值升至第二预设温度值时恒温反应一段时间，反应结束后冷却至温室，经离心和透析后制备得到铜掺杂普鲁士蓝纳米酶。
7、优选地，所述三价铁盐包括铁氰化钾。
8、优选地，所述二价铜盐包括五水硫酸铜。
9、优选地，所述表面封端剂包括聚乙烯吡咯烷酮，溶解表面封端剂的溶剂为无水乙醇。进一步地，所述表面封端剂选用聚乙烯吡咯烷酮k30。
10、优选地，所述盐酸浓度为1mol/l，所述无水乙醇与所述盐酸的体积比为3∶1。
11、其中，pvp作为表面配体，增加了初级pbnz纳米晶核之间的空间位阻，并阻碍了它们的定向组装。其次，乙醇减小了初级水平形成的纳米晶核的尺寸，增强了pvp分子和纳米晶核内铁离子之间的相互作用力。因为pvp聚合物链在乙醇溶液中呈伸展状态，而在水溶液中呈卷曲状态，通过增加乙醇的比例可以使pvp链伸展开，由于空间位阻的作用，增加核与核之间的距离，防止小核生长为更大的核。本专利技术尝试过加入10000da分子量的pvp进行合成，最终产物颗粒很大，不能合成小尺寸的产物；随着pvp分子量升高，其在极性溶剂中的溶解度会下降，同时体系的粘度也会升高(无论是水溶液还是乙醇溶液)，因此不能选用分子量过高的pvp。综合考虑，选用平均分子量为40000da的pvp-k30。
12、优选地，所述第一预设温度值为40℃，所述第二预设温度值为80℃，恒温反应时间为2-3h。
13、其中，0-40℃反应体系中仅有k3[fe(cn)6]与pvp，pvp的酰胺基团与fe3+配位；40-80℃向体系中加入cuso4，形成cu-cn-fe结构。分步反应，通过先添加铁源，再在特定温度下加入铜源，实现对铜掺杂普鲁士蓝纳米酶合成过程的精细调控，有利于改善纳米酶的形貌、结晶度及铜离子的均匀分布，从而提高其催化性能。
14、本专利技术提供一种铜掺杂普鲁士蓝纳米酶，所述铜掺杂普鲁士蓝纳米酶由所述的制备方法制备而成，所述铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的平均粒径为24.6±0.3nm，表明该制备方法能生成粒径均一、尺寸可控的纳米酶，有利于实现催化活性、稳定性以及生物相容性的优化。
15、本专利技术提供一种铜掺杂普鲁士蓝纳米酶在过氧化氢或抗坏血酸浓度的检测中的应用。
16、优选地，过氧化氢浓度的检测方法为：
17、构建标准曲线：配置不同浓度的过氧化氢溶液，并添加醋酸-醋酸钠缓冲液、tmb溶液和铜掺杂普鲁士蓝纳米酶，均匀混合后恒温反应一段时间，然后在652nm的波长下检测吸收峰值，拟合得到吸光峰值与过氧化氢浓度的标准曲线；
18、测定样品中的过氧化氢浓度：按照标准曲线的方法对样品进行测定，代入标准曲线中得到样品中的过氧化氢浓度。
19、优选地，抗坏血酸浓度的检测方法为：
20、构建标准曲线：配置不同浓度的抗坏血酸溶液，并添加醋酸-醋酸钠缓冲液、tmb溶液、铜掺杂普鲁士蓝纳米酶和过氧化氢溶液，均匀混合后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述三价铁盐包括铁氰化钾。
3.根据权利要求1所述的铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述二价铜盐包括五水硫酸铜。
4.根据权利要求1所述的铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述表面封端剂包括聚乙烯吡咯烷酮，溶解表面封端剂的溶剂为无水乙醇；所述盐酸浓度为1mol/L，所述无水乙醇与所述盐酸的体积比为3：1。
5.根据权利要求1所述的铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述第一预设温度值为40℃，所述第二预设温度值为80℃，恒温反应时间为2-3h。
6.一种铜掺杂普鲁士蓝纳米酶，其特征在于，所述铜掺杂普鲁士蓝纳米酶由权利要求1-5任一项所述的制备方法制备而成，所述铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的平均粒径为24.6±0.3nm。
7.一种如权利要求6所述的铜掺杂普鲁士蓝纳米酶在过氧化氢或抗坏血酸浓度的检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，抗坏血酸浓度的检测方法为：
10.根据权利要8或9所述的应用，其特征在于，醋酸-醋酸钠缓冲液的pH＝6，铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的浓度为2500ppm，恒温反应温度为50℃。
...【技术特征摘要】
1.一种铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述三价铁盐包括铁氰化钾。
3.根据权利要求1所述的铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述二价铜盐包括五水硫酸铜。
4.根据权利要求1所述的铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述表面封端剂包括聚乙烯吡咯烷酮，溶解表面封端剂的溶剂为无水乙醇；所述盐酸浓度为1mol/l，所述无水乙醇与所述盐酸的体积比为3：1。
5.根据权利要求1所述的铜掺杂普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述第一预设温度值为40℃，所述第二预设温度值为80℃，...
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