【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物领域，主要涉及一种多囊卵巢综合征动物模型的制备方法，尤其是涉及一种构建多囊卵巢综合征小鼠的方法。
技术介绍
1、多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，pcos)是一种常见的生殖内分泌疾病，是导致育龄女性无排卵性不育的主要疾病，发病率为6％～10％。pcos的病理生理改变包括高雄激素血症、卵巢多囊样改变、稀发性排卵/无排卵、胰岛素抵抗等生殖、内分泌和代谢异常。pcos的临床表现异质性高，根据2003年鹿特丹标准，需满足以下标准中至少两项方能诊断为pcos：①高雄激素血症(hyperandrogenemia，ha)；②排卵障碍(ovulatorydysfunction，od)；③卵巢多囊样改变(polycystic ovarian morphology，pcom)。根据pcos患者的临床特点可将其分为四型，其中a型(ha+od+pcom)和b型(ha+od)为经典pcos，占pcos患者的40％～45％；约有35％的pcos患者表现为c型(ha+pcom)，即排卵性pcos；20％左右的pcos患者雄激素水平并不升高，为非高雄激素性pcos(d型：od+pcom)。
2、通过大量的临床样本筛查，发现临床中pcos患者中的foxo1在颗粒细胞中的表达量呈现差异性的变化。foxo1是foxo转录因子亚家族中的一员,并且也是卵巢颗粒细胞特异表达的基因之一，在生长期卵泡中的颗粒细胞中表达,并在颗粒细胞的增殖,卵泡的发育、闭锁和黄体化中扮演重要角色。
3、2019年山东大学生
技术实现思路
1、pcos病因和发病机制复杂，目前pcos患者的治疗以对症治疗为主，且临床取材困难，建立动物模型有助于深入研究pcos的病因和发病机制，对pcos的治疗有重要意义，但至今仍没有广泛公认的动物模型。虽然很多研究团队对foxo1基因与pcos的发病等进行了研究，但目前的研究结果均未明确确认foxo1基因与pcos的直接关系，同时也没有明确foxo1基因及其表达的蛋白的变化与pcos的进一步分型的关系。本申请意在进一步研究foxo1基因与pcos之间的关系，并意在进一步构建有效的pcos动物模型。
2、现有技术中对于pcos的小鼠模型的构建方法主要分为：
3、1.用激素诱导的方法构建小鼠模型。
4、1)睾酮(tp)诱导：宫内高水平雄激素暴露是pcos发生的重要原因。游离睾酮处理孕鼠可直接诱导其雌性子代出现高雄激素血症，同时伴有动情周期紊乱、卵巢窦状卵泡增加和促性腺激素分泌紊乱，孕期或产后丙酸睾酮处理也可诱导类pcos表型的产生。睾酮处理可诱导大鼠出现类pcos患者的生殖和代谢表型，但除了雄激素水平升高，睾酮处理后大鼠的其他激素水平变化与pcos患者不一致。因此，睾酮处理并不能很好地模拟pcos患者的内分泌紊乱。
5、2)脱氢表雄酮(dhea)诱导：用dhea诱导pcos啮齿类动物模型的方法较为一致，即在青春期前大鼠/小鼠皮下注射溶于芝麻油的dhea，连续处理20～21d。但在3周龄小鼠皮下埋置7.5mg dhea缓释剂(连续释放90d)后，小鼠并未出现明显的生殖内分泌改变，不推荐作为pcos动物造模方法。
6、3)双氢睾酮(dht)诱导：dht是一种不可芳香化的雄激素，可排除雌激素对造模的影响。产后和产前dht处理均可诱导pcos啮齿类动物模型的产生。产前和产后dht处理均可诱导小鼠/大鼠出现动情周期紊乱和卵巢多囊样改变，但这两种pcos模型的发育模式差别较大，可能导致表型上的差别。孕期或产后dht处理的大鼠/小鼠的代谢特征与pcos患者类似，均可用于研究pcos代谢异常发病机制，产前dht暴露的啮齿类动物模型更适用于pcos神经内分泌发病机制的研究。
7、4)来曲唑诱导：
8、来曲唑诱导的pcos动物模型出现高雄激素分泌、卵巢形态改变、lh/fsh比值升高等与pcos患者类似的表型，同时还能模拟pcos患者的代谢表型。此外，不同的给药方式也会影响实验结果。
9、5)amh诱导：产前amh处理可激活小鼠下丘脑神经元，使其释放gnrh增加，垂体lh脉冲释放的频率增加，小鼠出现动情周期紊乱、生育力下降、雄激素和lh水平升高等特征，可以较好地模拟pcos患者的生殖内分泌表型；此模型中小鼠体质量正常，糖耐量受损，未报道其他代谢异常，目前产前amh造模的研究较少，其对代谢的影响还有待研究。amh处理的小鼠模型或许可用于非肥胖的pcos患者的发病机制的研究。
10、6)米非司酮诱导：经过米非司酮诱导后的大鼠出现动情周期紊乱，以及卵泡发育停滞、闭锁增加、颗粒细胞层变薄等卵巢病理改变。此外，大鼠还出现激素分泌异常，血清睾酮、雌二醇水平升高；lh水平升高，fsh水平升高或不变，lh/fsh比值增大；孕酮水平降低或不变，催乳素水平升高。但大鼠并未出现代谢异常。因此，米非司酮诱导的pcos模型可用于pcos排卵障碍的相关研究，而不适用于pcos代谢异常的研究。
11、7)雌激素诱导：雌激素诱导处理并不能诱导大鼠出现高雄激素血症。此外，雌激素诱导处理后大鼠代谢表型在各项研究中不一致，其代谢异常表型还需进一步研究证实。
12、2.使用肠道菌群处理：pcos患者与正常女性的肠道微生物组成有较大差异，但肠道菌群在pcos发生中的作用仍未可知。现有技术中，肠道菌群失调通过影响胆汁酸代谢和il-22的分泌，抑制白色脂肪棕色化和促进卵巢局部炎症，促进pcos的发生。普通拟杆菌灌胃的小鼠出现卵巢多囊样改变和高雄激素血症，能较好地模拟pcos患者的代谢紊乱状态，可用于pcos代谢性发病机制的研究。
13、3.用基因修饰动物模型：
14、lhβ亚基过表达小鼠其排卵减少、黄体期延长、卵巢表型各异，包括出血性囊肿、黄体增加和颗粒细胞瘤，其lh、睾酮和雌二醇水平升高。此外，lhβ基因过表达小鼠还表现为体质量增加，肥胖、腹部脂肪增加，血清胰岛素、瘦素水平升高，胆固醇和高密度脂蛋白水平下降等代谢异常。该小鼠模型卵巢病理改变与pcos患者卵巢表型不一致，肿瘤发生风险也增加，可能更适用于pcos代谢性发病机制的研究。
15、卵巢ngf过表达小鼠模型，该小鼠阴道开口延迟、生育力降低，产仔数减少。与对照组相比，该小鼠卵巢小窦状卵泡增加、闭锁卵泡增加，颗粒细本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种对非人动物进行基因改造的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，对非人动物的受精卵进行基因改造是通过将所述注射液注射到受精卵的细胞核或细胞质来完成的；
3.根据权利要求1所述的方法，其中，
4.根据权利要求4所述的方法，其中，所述用于同源重组的线性DNA模板、用于表达Cas9的mRNA和sgRNA的体积比为10：5：10。
5.一种构建多囊卵巢综合征疾病动物模型的构建方法，其包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其中，对非人动物的受精卵进行基因改造是通过将所述注射液注射到受精卵的细胞核或细胞质来完成的；
7.根据权利要求5所述的方法，其中，
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述用于同源重组的线性DNA模板、用于表达Cas9的mRNA和sgRNA的体积比为10：5：10。
9.根据权利要求5～8中任一项所述的方法，其构建的多囊卵巢综合征疾病动物模型是肥胖型多囊卵巢综合征动物模型。
10.线性DNA，其包含将FOXO1蛋白的7个磷酸化位点突变后的编码序列
11.一种对非人动物进行基因改造的方法，其包括：
12.根据权利要求11所述的方法，其中，特异性敲除非人动物的颗粒细胞中目标基因是通过使在所述目标基因中插入了loxP位点的非人动物与能够在颗粒细胞表达Cre酶的重组非人动物进行杂交获得；
13.一种构建多囊卵巢综合征疾病动物模型的构建方法，其包括：
14.根据权利要求13所述的方法，其中，特异性敲除非人动物的颗粒细胞中目标基因是通过使在所述目标基因中插入了loxP位点的非人动物与能够在颗粒细胞表达Cre酶的重组非人动物进行杂交获得；
15.根据权利要求13或14所述的方法，其构建的多囊卵巢综合征疾病动物模型是非肥胖型多囊卵巢综合征动物模型。
...【技术特征摘要】
1.一种对非人动物进行基因改造的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，对非人动物的受精卵进行基因改造是通过将所述注射液注射到受精卵的细胞核或细胞质来完成的；
3.根据权利要求1所述的方法，其中，
4.根据权利要求4所述的方法，其中，所述用于同源重组的线性dna模板、用于表达cas9的mrna和sgrna的体积比为10：5：10。
5.一种构建多囊卵巢综合征疾病动物模型的构建方法，其包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其中，对非人动物的受精卵进行基因改造是通过将所述注射液注射到受精卵的细胞核或细胞质来完成的；
7.根据权利要求5所述的方法，其中，
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述用于同源重组的线性dna模板、用于表达cas9的mrna和sgrna的体积比为10：5：10。
9.根据权利要求5～8中任一项所述的方法，其构建...
【专利技术属性】
技术研发人员：高飞，王梦月，崔秀宏，李佳伊，沈志明，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：
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