【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程、合成生物学，具体涉及一株大肠杆菌及其制备重组人源ⅲ型胶原蛋白的方法。
技术介绍
1、胶原蛋白是一种广泛存在于脊椎动物体内的重要结构蛋白，也是人体中含量最多的蛋白质，约占人体蛋白质总量的25-30％。同时作为一种糖蛋白，根据组织部位、生理功能、分子结构不同可以分为许多种胶原蛋白，其中占比最多、研究最为透彻的为ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型胶原蛋白。ⅰ型胶原主要分布于人体皮肤、肌腱，ⅲ型胶原主要分布于血管内膜、肠道中。人源胶原蛋白是人体细胞外基质的重要组成成分，可以维持皮肤、软骨、韧带、内脏等多种组织器官的结构与功能，主要功能体现在维护人体细胞环境，修复损伤、维持组织器官的正常生理功能等。具有生物可降解性、较低免疫原性、生物可吸收性、促进细胞增殖分化的特性，在食品、医药、生物材料及美容护肤等领域有着重要应用。
2、人源ⅲ型胶原蛋白是由三条相同的α1链相互缠绕而成的三股螺旋状的同源三聚体，其多肽链的区段序列由大量gly-x-y氨基酸序列重复组合而成，有着很好的生物活性及组织相容性。传统的胶原蛋白生产方法是通过酸碱或酶处理动物来源的组织，但该方法所提取的胶原蛋白易失去其生物活性，且可能产生免疫排斥反应，无法满足医疗、食品、化妆品等领域的需求。化学合成法虽可解决传统提取方法导致的免疫排斥等安全隐患问题，但技术复杂成本较高，无法大规模用于胶原蛋白的生产。随着生物技术发展，人们通过基因工程技术尝试使用各种表达系统制备重组人源胶原蛋白，取得了显著的成果。目前已有多种研究利用大肠杆菌、酵母、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞进
3、由于细菌培养周期短、遗传操作简单、生产成本低，故相关的蛋白质表达系统应用较为广泛。大肠杆菌是一种广泛用于基础研究和生产的重要模式菌株，具有遗传背景清晰的优势。作为经典的原核表达系统，大肠杆菌工程菌已经研究较为透彻，相关表达的调控机理也已十分清楚。此外，该原核表达系统的选择性较多，具有多种载体与表达菌株以满足不同的表达需求。同时，简单的操作与规模化的发酵使得生产成本大幅降低，是一种生产异源蛋白的理想宿主。
4、大肠杆菌的表达系统由表达载体和表达菌株组成。常用的表达载体包括pet质粒系统、pmal质粒系统、pgex质粒系统等，其中pet系列质粒被认为是目前表达外源蛋白最高效的系统，拥有t7强启动子。表达菌株常见的有e.coli bl21(de3)、rosetta(de3)、origami2等，其中bl21(de3)缺少lon、ompt蛋白酶基因，无法降解外源蛋白，同时具有t7强启动子；rosetta(de3)补充了大肠杆菌6种稀有密码子(aug、agg、aga、cua、ccc和gga)所对应的trna，大大提高了基因的表达能力；origami 2可显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达。
5、但是大肠杆菌在产生大量的真核蛋白过程中由于其原核生物的特性，所产生的目的蛋白多以不溶性的包涵体形式存在于胞内，不具备生物活性。同时包涵体的变复性操作较为繁琐，纯化过程也受到一定的影响，这在一定程度上限制了外源蛋白的生产。为了解决这一问题，科研人员多采用将外源真核的目的蛋白与融合蛋白标签进行连接，以增强目的蛋白的可溶性，在一定程度上可以解决包涵体的问题。
6、将促溶标签连接到目的蛋白的n端或c端，促溶标签会辅助蛋白质进行折叠，从而降低包涵体的形成；部分标签还可以定位在细胞内的特定位置、避免被胞内蛋白酶降解，提高了重组蛋白的结构稳定性；此外，促溶标签还具有亲和能力，可以到达纯化蛋白的目的。目前常用的融合促溶标签包括硫氧还蛋白a(thioredoxin a,trxa),谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione s-transferase,gst)、麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,mbp)等。其中trxa是一类氧化还原酶，它可以辅助蛋白质的正确折叠，具有良好的热稳定性；gst是一种很常见的蛋白融合标签，它与谷胱甘肽亲和力较强，蛋白纯化效果较好；mbp由大肠杆菌k12中male产生，分子量大约为42kda左右，促溶效率高、价格较低、可与直链淀粉柱特异性结合，纯化过程温和。
7、选择麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,mbp)作为融合蛋白标签与目的蛋白进行连接，并在rosetta菌株中进行表达，该重组人源ⅲ型胶原蛋白的表达系统可以提高蛋白质的合成量，满足外源蛋白高效重组表达的目的。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一株大肠杆菌及其制备重组人源ⅲ型胶原蛋白的方法。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一株大肠杆菌，所述大肠杆菌为大肠杆菌hf_iim_e.coli_rcol3a1，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期为2023年9月25日，菌种保藏编号为cctcc no:m 20231780。
3、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种由权利要求1所述的大肠杆菌发酵制得的重组人源ⅲ型胶原蛋白，氨基酸序列如seq id no.2所示。
4、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种编码权利要求2所述的重组人源ⅲ型胶原蛋白的基因，核苷酸序列如seq id no.3所示。
5、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一株制备重组人源ⅲ型胶原蛋白的方法，包括下列步骤：
6、步骤1：将成功转化的大肠杆菌hf_iim_e.coli_rcol3a1转接到添加有氯霉素和卡那霉素的lb培养基中，在35-40℃、100-300rpm条件下活化培养10-12h，获得发酵种子液；
7、步骤2：将发酵种子液转接到tb发酵培养基上，在35-40℃、100-300rpm条件下发酵20-50h，发酵液经后处理后得到重组人源ⅲ型胶原蛋白。
8、由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有的优点是：
9、本专利技术所选择的序列完全来自于人的ⅲ型胶原蛋白区域，在不影响氨基酸序列的前提下进行密码子的优化；采用大肠杆菌表达系统，生产成本较低；将目的蛋白与蛋白融合标签进行连接，大大提高蛋白的可溶性，解决了包涵体的问题；目的蛋白纯度与产量较高，发酵产量可达到911mg/l目的蛋白；本专利技术所获得的重组人源ⅲ型胶原蛋白序列及结构更接近于人体ⅲ型胶原蛋白，有着良好的生物活性和较低的免疫原性。
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1.一株大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌hf_M_E.coli_rCOL3A1，已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日期为2023年9月25日，菌种保藏编号为CCTCCNO:M 20231780。
2.一种由权利要求1所述的大肠杆菌发酵制得的重组人源Ⅲ型胶原蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种编码权利要求2所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一株制备重组人源Ⅲ型胶原蛋白的方法，其特征在于：包括下列步骤：
【技术特征摘要】
1.一株大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌hf_m_e.coli_rcol3a1，已保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏日期为2023年9月25日，菌种保藏编号为cctccno:m 20231780。
2.一种由权利要求1所述的大肠杆菌发酵制得...
【专利技术属性】
技术研发人员：王鹏，程诚，王丽，王晗，赵根海，郑之明，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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