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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制剂领域,具体而言,涉及一种巨噬细胞膜包覆bcg的靶向生物制剂。
技术介绍
1、训练免疫,又称天然免疫记忆,是近二十年来免疫学研究领域的一个新的扩展领域,颠覆了传统认为只有特异性免疫细胞如t细胞,b细胞才能产生针对特异性抗原的免疫记忆的观点。研究发现,包括单核细胞和巨噬细胞在内的许多天然免疫细胞在经过某些抗原刺激后会形成免疫记忆,对相同抗原或不同抗原的再次刺激会迅速做出非特异免疫应答,通过释放更多的细胞因子达到迅速对抗病原侵染或清除癌细胞的目的。bcg是最早被证明能够诱导天然免疫细胞产生训练免疫的微生物,由于其本身是临床预防结核分枝杆菌感染的减毒活疫苗,具有很高的临床安全适用性,并且常被用作多种癌症治疗推荐使用的免疫佐剂,特别是在膀胱癌的治疗中具有显著疗效。但由于其本身具有的免疫原性,bcg在其他肿瘤的治疗中还具有一定局限性。目前的研究认为,bcg发挥的肿瘤治疗效果与其能够诱导巨噬细胞训练免疫有关,靶向调控天然免疫细胞,如巨噬细胞的训练免疫是未来肿瘤治疗中极具发展潜力的新策略。
2、经过免疫训练的巨噬细胞已被证明在卡介苗的抗肿瘤活动中发挥关键作用,特别是对膀胱癌。在这项研究中,我们探索了一种简单的策略,利用巨噬细胞膜来帮助卡介苗靶向肿瘤组织,并诱导肿瘤内巨噬细胞的训练免疫,从而激活或增强巨噬细胞介导的抗肿瘤非特异免疫反应,发挥抗肿瘤疗效。
3、目前,利用天然细胞的细胞膜包覆纳米颗粒可以赋予纳米颗粒多种生物功能。例如,利用红细胞膜包覆纳米颗粒,可以延长纳米颗粒在血液系统中的循环和驻留时间,
4、其中卡介苗(bcg)是一种预防结核病的经典疫苗,具有很长的临床接种历史,疫苗安全性具有可靠保障。卡介苗(bcg)在临床肿瘤免疫治疗中常使用的免疫佐剂,如治疗膀胱癌。作为减毒的活菌疫苗,由于其容易被机体免疫系统识别和清除,往往导致其介导的肿瘤免疫治疗效果不佳。卡介苗(bcg)在肿瘤免疫治疗中使用的给药方式通常为肿瘤部位直接给药,由于bcg本身不具备直接靶向肿瘤组织的能力,因此通过静脉注射的给药方式往往无法达到预期治疗效果。卡介苗(bcg)发挥肿瘤治疗效果的机制与其能够诱导巨噬细胞训练免疫(trained immunity)有关,bcg通过诱导巨噬细胞训练免疫增强巨噬细胞分泌非特异性免疫反应发挥抗肿瘤效果,同时在启动后续t细胞介导的抗肿瘤特异性免疫反应中发挥重要作用。卡介苗对肺癌的治疗有一定的效果,但由于肺组织器官的特殊功能结构,通常不采用针对肺肿瘤组织的卡介苗直接给药,如何提升卡介苗在肺肿瘤中的免疫治疗效果,目前尚未有明确的临床使用方案。
5、肺癌在手术、化疗、放疗和传统免疫治疗方面都存在一定的局限性,治疗效果往往不佳。传统的免疫治疗在肺癌的情况下,很难准确到达肿瘤组织,达到治疗效果。研究表明,卡介苗在预防结核病以外,例如膀胱癌的治疗中有良好的免疫治疗效果。但目前通常采用卡介苗在肿瘤组织的直接给药方式,来达到治疗效果。考虑到肺癌所在的肺部组织的特殊性而言,这个方案往往不宜实行,且难以达到预期效果。肺部入血为静脉血,通过静脉注射给药方式具有一定可行性。但由于卡介苗作为一种减毒活疫苗,其本身具有的微生物免疫原性容易导致机体免疫系统对其的识别很清楚,直接注射卡介苗难以有效保证其有效到达肺部肿瘤部位,受巨噬细胞膜的获取的方法限制,目前难以大规模生产,故在生产效率上尚需优化;因此我们对此做出改进,提出一种巨噬细胞膜包覆bcg的靶向生物制剂。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于:针对目前存在的
技术介绍
提出的问题。为了实现上述专利技术目的,本专利技术提供了以下技术方案:一种巨噬细胞膜包覆bcg的靶向生物制剂,包含以下成分:raw264.7 dmem完全培养基(含有10%的胎牛血清(fbs)和1%青霉素/链霉素)以及5%二氧化碳,牛分枝杆菌卡介苗(bcg),middlebrook7h9肉汤培养基,middlebrook白蛋白葡萄糖过氧化氢酶添加剂(adc)(10%v/v);
2、非离子型表面活性剂tween 80(0.05%v/v),middlebrook7h10琼脂培养基,trsi盐酸盐(0.1m),mgcl2(1mm),苯基甲基磺酰氟化物(pmsf,2mm),蔗糖(0.35m),脱氧核糖核苷酸酶dnase(10μg ml-1),磷酸缓冲液pbs,细胞裂解液(ph 7.4)。
3、作为本专利技术优选的技术方案,还包括细胞系和细菌培养,具体包括以下制备步骤:
4、s1、raw264.7细胞系用dmem完全培养基在37摄氏度,5%的二氧化碳细胞培养箱中适度加湿条件培养;
5、s2、牛分枝杆菌卡介苗(bcg)在middlebrook 7h9肉汤培养基培养,需补充middlebrook白蛋白葡萄糖过氧化氢酶添加剂(adc)(10%v/v)和非离子型表面活性剂tween 80(0.05%v/v)于37摄氏度下培养;
6、s3、使用分光光度计测定600纳米(od600)波长时的细菌生长光学密度(od600);
7、s4、通过将培养物连续稀释到middlebrook7h10琼脂培养基上并在37摄氏度下培养四周,并进行菌落总数计数。
8、作为本专利技术优选的技术方案,还包括细胞膜制备,具体包括以下制备步骤:
9、s1、raw264.7细胞在含有trsi盐酸盐(0.1m),mgcl2(1mm),苯基甲基磺酰氟化物(pmsf,2mm),蔗糖(0.35m)和脱氧核糖核苷酸酶dnase(10μg ml-1)的冰冷细胞裂解液(ph7.4)中重悬,4摄氏度下培养30分钟;
10、s2、随后使用超声波仪器在150w超声3min以破碎细胞,然后4摄氏度,4000rpm冷冻离心10分钟;
11、s3、取上清液4摄氏度和10000rpm冷冻离心20分钟;弃去上清液,沉淀物用细胞裂解液裂解处理,然后进行透析去除缓冲液中的盐分;
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【技术保护点】
1.一种巨噬细胞膜包覆BCG的靶向生物制剂,其特征在于,包含以下成分:RAW264.7DMEM完全培养基,所述RAW264.7 DMEM完全培养基含有10%的胎牛血清FBS和1%青霉素/链霉素以及5%二氧化碳,牛分枝杆菌卡介苗BCG,Middlebrook7H9肉汤培养基,Middlebrook白蛋白葡萄糖过氧化氢酶添加剂,所述Middlebrook白蛋白葡萄糖过氧化氢酶添加剂的含量为ADC10%;
2.根据权利要求1所述的一种巨噬细胞膜包覆BCG的靶向生物制剂,其特征在于,还包括细胞系和细菌培养,具体包括以下制备步骤:
3.根据权利要求2所述的一种巨噬细胞膜包覆BCG的靶向生物制剂,其特征在于,还包括细胞膜制备,具体包括以下制备步骤:
4.根据权利要求3所述的一种巨噬细胞膜包覆BCG的靶向生物制剂,其特征在于,巨噬细胞包覆卡介苗的制备,具体包括以下制备步骤:
【技术特征摘要】
1.一种巨噬细胞膜包覆bcg的靶向生物制剂,其特征在于,包含以下成分:raw264.7dmem完全培养基,所述raw264.7 dmem完全培养基含有10%的胎牛血清fbs和1%青霉素/链霉素以及5%二氧化碳,牛分枝杆菌卡介苗bcg,middlebrook7h9肉汤培养基,middlebrook白蛋白葡萄糖过氧化氢酶添加剂,所述middlebrook白蛋白葡萄糖过氧化氢酶添加剂的含量为adc10%;<...
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