【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗体检测，涉及一种血小板抗体的细胞学比对检测法及试剂盒。
技术介绍
1、血小板含有多种抗原分子，这些抗原主要为两类：一类是与其他组织或细胞共有的抗原，如abo血型、人类白细胞hla抗原(human leukocyte antigen，hla)以及gpⅳ/cd36抗原等；而另一类即为人类血小板特异性抗原(human platelet antigens，hpa)。对这些抗原分子的抗体是血小板减少症的主要原因，包括难治性血小板减少症、输血后紫癜(post-transfusion purpura，ptp)、新生儿同种免疫性血小板减少症(neonatal alloimmunethrombocytopenia，nait)和特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenicpurpura)。因此，hpa抗体的检测是诊断和预防这些疾病的一个重要目标。
2、目前，检测hpa抗体的方法有多种，包括基于酶联免疫吸附(enzyme linkedimmunosorbent assay，elisa)的血小板相关抗体检测(platelet associatedimmunoglobulin，paigg)、抗原捕获酶联免疫吸附试验(modified antigen captureelisa，mace)、单克隆抗体特异性血小板抗原捕获法(monoclonal antibody specificimmobilization of platelet antigen，maipa)，基于红细胞指示的固相凝集法(soli
3、maipa是检测血小板抗体的金标准，可以鉴别hla抗体和hpa抗体，但实验较为繁琐，仅限用于专业参考实验室，临床应用较少。paigg、sprca和mgt是国内临床应用最广泛的血小板抗体检测技术，但这两种方法敏感度低，不能区分hla和hpa抗体，且易漏检低频hpa、igm和iga类血小板抗体，同时高滴度hla抗体阻碍hpa抗体的检测。fcm是使用受者血小板与供者血清反应，虽敏感性和特异性较高，但同样不能区分hla和hpa抗体。且这些方法均依赖于特征良好的血小板的制备。而luminex免疫磁珠法是将纯化得到的gp或血小板成分、部分hla ι类抗原、cd36抗原偶联至荧光微球上，从而检测hpa和hla抗体。且该试剂不需要活细胞、操作简单、可重复性好，能区分是哪一种分型的hpa抗原，是目前血小板检测方法的热点。但该试剂盒的血小板抗原谱与中国人群有较大的差异，检测时由于供者特异性hpa抗原的缺失，有可能导致漏检(如漏检中国人群出现频率比较高的hpa15a/b)。同时抗原在制备成血小板抗体检测试剂盒前，需经历细胞裂解、纯化、洗杂、洗脱、浓缩以及固相载体包被等一系列操作步骤，易使供者抗原发生结构变性，而出现假阳性(血小板抗体检测技术研究进展王慧李剑平(2011)03-24-06.中国输血杂志doi:10.13303/j.cjbt.issn.1004-549x.2011.03.034)。
技术实现思路
1、针对上述检测血小板抗体检测技术均有现阶段无法解决的缺点，本专利技术提供了一种血小板抗体的细胞学比对检测法及试剂盒，通过重组表达特定基因型的hpa的宿主细胞，检测供者血清中的特异性的hpa抗体。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种血小板抗体的细胞学比对检测法，包括：
4、1)在宿主细胞中导入hpa抗原的表达基因，制备成细胞表面表达特定的hpa抗原的hpa抗体检测细胞；所述宿主细胞包括不表达人类白细胞抗原(hla)、血小板特异性抗原(hpa)、cd36或对正常人类血清样本无背景反应性的宿主细胞。
5、2)使用hpa抗体检测细胞与受者的血清进行反应，检测被检样本中的hpa抗体。
6、进一步的，步骤1)中，所述的宿主细胞包括从人体或其他哺乳类动物的骨髓中分离的细胞、血管内皮细胞、外周血细胞或者从组织中纯化的细胞，以及上述细胞在体外培养获得的细胞系。
7、进一步的，步骤1)中，所述的hpa抗原的表达基因主要包括6种血小板膜糖蛋白gpⅲa、gpⅱb、gpⅰa、gpⅰbα、gpⅰbβ、cd109。
8、进一步的，步骤1)中，所述的在宿主细胞中导入hpa的表达基因的方式包括物理法—电穿孔、显微注射和基因枪法等；化学法—磷酸钙共沉淀、脂质体转染和多种阳离子物质介导的技术等；生物法—原生质体转染和由病毒介导的转染技术等。
9、进一步的，步骤1)中还包括，hpa的表达基因导入宿主细胞系后，需验证以确认hpa在细胞表面的表达量。
10、进一步的，步骤2)中，hpa抗体检测方法包括流式细胞检测法和荧光显微镜观察法。
11、更进一步的，检测宿主细胞和hpa抗体检测细胞表面结合的荧光标记二抗的荧光强度，并比较两者的水平差异，定性判断患者血清中是否存在血小板抗体。
12、本专利技术还提供了一种血小板抗体的细胞学比对检测试剂盒，包括宿主细胞和hpa抗体检测细胞，所述宿主细胞包括不表达人类白细胞抗原(hla)、血小板特异性抗原(hpa)、cd36或对正常人类血清样本无背景反应性的宿主细胞，所述hpa抗体检测细胞表面表达特定的hpa抗原。
13、进一步的，所述的宿主细胞包括从人体或其他哺乳类动物的骨髓中分离的细胞、血管内皮细胞、外周血细胞或者从组织中纯化的细胞，以及上述细胞在体外培养获得的细胞系。
14、进一步的，所述的hpa抗原的表达基因主要包括6种血小板膜糖蛋白gpⅲa、gpⅱb、gpⅰa、gpⅰbα、gpⅰbβ、cd109。
15、本专利技术具有如下有益效果：
16、本专利技术既解决了目前临床应用最广泛的血小板抗体检测技术(paigg、sprca和mgt)中，敏感度低，不能区分hla和hpa抗体，且易漏检低频hpa抗体、漏检igm或iga类hpa抗体的问题。又解决了纯化抗原法中，因抗原纯化操作使供者抗原发生结构变性，或者非人源细胞表达的抗原仿真度不够，易出现假阳性的问题。
17、基于本专利技术提供的细胞学比对检测法，可以进一步制备成相应的试剂盒用于血小板抗体检测。本专利技术可用于检测患者体内是否存在特定血小板抗原的相应抗体，有利于合适的血小板供体的选择，避免患者因输注血小板时，因预存的血小板抗体而导致的抗体介导的免疫反应。
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1.一种血小板抗体的细胞学比对检测法，包括：
2.根据权利要求1所述的一种血小板抗体的细胞学比对检测法，其特征在于，步骤1)中，所述的宿主细胞包括从人体或其他哺乳类动物的骨髓中分离的细胞、血管内皮细胞、外周血细胞或者从组织中纯化的细胞，以及上述细胞在体外培养获得的细胞系。
3.根据权利要求1所述的一种血小板抗体的细胞学比对检测法，其特征在于，步骤1)中，所述的HPA抗原的表达基因包括6种血小板膜糖蛋白GPⅢa、GPⅡb、GPⅠa、GPⅠbα、GPⅠbβ、CD109。
4.根据权利要求1所述的一种血小板抗体的细胞学比对检测法，其特征在于，步骤1)中，所述的在宿主细胞中导入HPA的表达基因的方式包括物理法—电穿孔、显微注射和基因枪法；化学法—磷酸钙共沉淀、脂质体转染和多种阳离子物质介导的技术；生物法—原生质体转染和由病毒介导的转染技术。
5.根据权利要求1所述的一种血小板抗体的细胞学比对检测法，其特征在于，步骤1)中还包括：HPA的表达基因导入宿主细胞系后，进行验证以确认HPA在细胞表面的表达量。
6.根据权利要求1所述的一
7.根据权利要求6所述的一种血小板抗体的细胞学比对检测法，其特征在于，检测宿主细胞和HPA抗体检测细胞表面结合的荧光标记二抗的荧光强度，并比较两者的水平差异，定性判断患者血清中是否存在血小板抗体。
8.一种血小板抗体的细胞学比对检测试剂盒，包括宿主细胞和HPA抗体检测细胞，所述宿主细胞包括不表达人类白细胞抗原HLA、血小板特异性抗原HPA、CD36或对正常人类血清样本无背景反应性的宿主细胞，所述HPA抗体检测细胞表面表达特定的HPA抗原。
9.根据权利要求8所述的一种血小板抗体的细胞学比对检测试剂盒，其特征在于，所述的宿主细胞包括从人体或其他哺乳类动物的骨髓中分离的细胞、血管内皮细胞、外周血细胞或者从组织中纯化的细胞，以及上述细胞在体外培养获得的细胞系。
10.根据权利要求8所述的一种血小板抗体的细胞学比对检测试剂盒，其特征在于，所述的HPA抗原的表达基因包括6种血小板膜糖蛋白GPⅢa、GPⅡb、GPⅠa、GPⅠbα、GPⅠbβ、CD109。
...【技术特征摘要】
1.一种血小板抗体的细胞学比对检测法，包括：
2.根据权利要求1所述的一种血小板抗体的细胞学比对检测法，其特征在于，步骤1)中，所述的宿主细胞包括从人体或其他哺乳类动物的骨髓中分离的细胞、血管内皮细胞、外周血细胞或者从组织中纯化的细胞，以及上述细胞在体外培养获得的细胞系。
3.根据权利要求1所述的一种血小板抗体的细胞学比对检测法，其特征在于，步骤1)中，所述的hpa抗原的表达基因包括6种血小板膜糖蛋白gpⅲa、gpⅱb、gpⅰa、gpⅰbα、gpⅰbβ、cd109。
4.根据权利要求1所述的一种血小板抗体的细胞学比对检测法，其特征在于，步骤1)中，所述的在宿主细胞中导入hpa的表达基因的方式包括物理法—电穿孔、显微注射和基因枪法；化学法—磷酸钙共沉淀、脂质体转染和多种阳离子物质介导的技术；生物法—原生质体转染和由病毒介导的转染技术。
5.根据权利要求1所述的一种血小板抗体的细胞学比对检测法，其特征在于，步骤1)中还包括：hpa的表达基因导入宿主细胞系后，进行验证以确认hpa在细胞表面的表达量。
6.根据权利要求1所述的一种血小板抗体...
【专利技术属性】
技术研发人员：张胜南，戴红霞，赵晨红，徐阳，王妍，张圆，位超，蔡俊超，王玲玲，
申请(专利权)人：苏州才博医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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