【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能够改变病毒的结合谱和/或修饰病毒的细胞向性的病毒衔接子蛋白。在一个方面，本专利技术涉及用于病毒的共价结合衔接子蛋白，其能够改变病毒的结合谱和/或修饰病毒的细胞向性。本专利技术还涉及所要求保护的病毒衔接子蛋白用于修饰病毒结合谱和细胞向性、以及作为用作药物的转导载体的用途。一方面，本专利技术涉及用于腺相关病毒(aav)的衔接子，其能够改变aav的结合谱和/或修饰aav的细胞向性。本专利技术还涉及所要求保护的aav衔接子用于修饰aav结合谱和细胞向性、以及作为用作药物的转导载体的用途。
技术介绍
1、腺相关病毒
2、腺相关病毒(aav)病毒属于细小病毒科。它们的特征是二十面体、无包膜衣壳，其直径为18至30nm且包含约5kb的线性单链dna。aav的有效复制需要宿主细胞与辅助病毒共感染，例如与腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒共感染。替代地，如果辅助aav复制所需的辅助病毒的病毒蛋白作为辅助质粒的一部分单独补充，则可以在不存在辅助病毒的情况下促进体外复制。这种生产方法是最常见的，被称为无辅助aav生产。在没有辅助病毒的情况下，aav进入静默状态，病毒基因组能够稳定整合到宿主细胞基因组中，尽管这种情况很少发生。aav感染广泛的分裂和非分裂细胞的能力、以及其病毒基因组在受感染细胞内游离存在或整合到宿主基因组内的能力，使其作为哺乳动物细胞的转导载体是特别感兴趣的。
3、一般来说，约145bp长的两个反向末端重复序列(itr)足以满足载体功能。它们携带复制、包装和整合到宿主细胞基因组中所需的“顺式(cis)”信
4、aav衣壳由以下项的三种不同的蛋白质组成：vp1、vp2和vp3，这三种不同的蛋白质的相对比例分别约为1:1:10，相当于8.3％的vp1、8.3％的vp2和83.3％的vp3。aav衣壳基因位于aav基因组的末端处，并且使用不同的起始密码子由相同的开放阅读框(orf)编码。vp1基因包含完整的vp2基因序列，而vp2基因序列又包含具有特定n-末端区域的完整vp3基因序列。一个阅读框编码所有三种aav衣壳蛋白这一事实导致了所有衣壳蛋白的强制共表达，尽管程度不同。
5、衣壳蛋白的分子量针对vp1为87kda、针对vp2为73kda并且针对vp3为62kda。例如，衣壳基因的序列描述于srivastava,a.等人(1983),j.virol.,45,555-564；muzyczka,n.(1992),curr.top.micro.immunol.,158,97-129、ruffing,n.等人(1992),j.virol.,66,6922-6930或rutledge,e.a.等人(1998)j.virol.72,309-319，所述文献通过引用以其整体并入本文。aav基因组的物理和基因图谱描述于例如kotin,r.m.(1994),human genetherapy,5,793-801，其通过引用以其整体并入本文。本文还在图7至19和seq id no 7-19中提供了示例性aav衣壳序列。
6、各种aav血清型还是已知的，在各种aav血清型中的人aav血清型2(aav2)代表具有用于体细胞基因疗法的有利特性的病毒载体。其基本优点是缺乏对人类的致病性、病毒基因组在受感染细胞中作为附加体持续存在或其稳定整合到细胞基因组中、感染非分裂细胞的能力、病毒粒子的稳定性(这使得纯化得到高滴度成为可能)、低免疫原性、以及在重组aav载体中基本上不存在病毒基因和基因产物，这从用于基因疗法的安全性的角度来看是有利的。现在，将基因克隆到aav载体中是通过技术人员通常已知的方法进行的，例如在以下项中进行描述的：wo 95/23 867、chiorini j.a.等人(1995),human gene therapy,6,1531-1541或kotin,r.m.(1994)，其通过引用以其整体并入本文。
7、例如，aav2通常具有宽活性谱(向性)。上皮组织(例如，人上皮肿瘤细胞系)以及原发性肿瘤物质(例如，宫颈癌或卵巢癌或黑色素瘤)和人角质形成细胞都被非常有效地感染(70-80％)，而造血细胞(例如，淋巴造血细胞)被感染的效率降低10倍至100倍(0.5-5％)(mass等人(1998)human gene therapy,9,1049-1059，其通过引用以其整体并入本文)。
8、原因之一可能是aav与细胞表面上的aav受体之间的相互作用对于将aav摄取到细胞中是必要的。因此，例如，假定的主要aav2受体是150kda的细胞膜糖蛋白(mizukami,h.等人(1996),virology,217,124-130，其通过引用以其整体并入本文)或硫酸乙酰肝素蛋白多糖(summerford,c.&samulski,r.j.(1998),j.virol.,72,1438-1445，其通过引用以其整体并入本文)。已经确定的可能的第二受体是：αvβ5整合素(summerford等人，(1999),naturemedicine 5,78-82，其通过引用以其整体并入本文)和人成纤维细胞生长因子受体1(qing等人，(1999)nature medicine 5,71-77，其通过引用以其整体并入本文)。结合研究现已经表明，在被aav2无效感染的细胞上，此类受体的表面密度会降低。
9、已知可以通过逆转录病毒和腺病毒的衣壳蛋白的基因修饰来引入仅在特定细胞上表达的受体的结合位点，并且因此使得受体介导的载体靶向成为可能(参见，例如，cosset,f.l.和russell,s.j.(1996),gene ther.,3,946-956、douglas,j.t.等人(1996),nat.biotechnol.,14,1574-1578、krasnykh,v.n.等人(1996),j.virol.,70,6839-6846、stevenson,s.c.等人(1997),j.virol.,71,4782-4790或wickman,t.j.等人(1996),nat.biotechnol.,14,1570-1573，其通过引用以其整体并入本文)。
10、wo 96/00587还涉及avv衣壳融合蛋白，该avv衣壳融合蛋白被认为是含有临床相关抗原的异源表位、被认为是诱导免疫应答并且被认为是不干扰衣壳形成。steinbach等人(1997)(biol.abstr.104,参考文献46570，其通过引用以其整体并入本文)涉及先前已在杆状细胞系统中表达的aav颗粒的体外组装。cap基因也发生突变，但这些突变并不是为了导致向性的改变，而是为了产生一种在每种情况下仅表达一个vp蛋白的质粒构建体。ruffing等人(1994)(j.gen.virol.75,3385-3392，其通过引用以其整体并入本文)旨本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种经分离的多肽，所述经分离的多肽包含能够与病毒衣壳共价结合的一个或多个半胱氨酸残基。
2.一种病毒衔接子分子，所述病毒衔接子分子包含：(i)经分离的多肽，所述经分离的多肽包含能够与病毒衣壳共价结合的一个或多个半胱氨酸残基；以及(ii)配体。
3.根据权利要求1所述的经分离的多肽，其中能够与病毒衣壳共价结合的所述一个或多个半胱氨酸残基与所述经分离的多肽是异源的。
4.根据权利要求2所述的病毒衔接子分子，所述病毒衔接子分子包含：(i)经分离的多肽，所述经分离的多肽包含能够与病毒衣壳共价结合的一个或多个半胱氨酸残基；以及(ii)配体，其中所述一个或多个半胱氨酸残基与所述经分离的多肽是异源的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子能够与未修饰的野生型病毒衣壳结合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子能够与相较于野生型病毒衣壳具有5个或更少个(例如，5个、4个、
7.根据权利要求1至6中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子能够与相对于野生型病毒衣壳具有不超过5个氨基酸(即，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸)的氨基酸插入或缺失的病毒衣壳结合。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子能够与相对于野生型病毒衣壳不具有插入或缺失的病毒衣壳结合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述经分离的多肽或病毒衔接子分子包含具有一个或多个半胱氨酸残基并且能够与腺相关病毒衣壳共价结合的腺相关病毒受体(AAVR，KIAA0319L)的一部分。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子包含柯萨奇病毒-腺病毒受体(CXADR)的一部分，任选地其中CXADR序列是SEQ ID NO:20。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子包含中和抗体A20的抗原结合部分。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述配体能够与细胞表面分子结合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述配体结合选自由以下项组成的列表的一种或多种细胞表面分子：
14.根据权利要求9至13中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中腺相关病毒受体(AAVR，KIAA0319L)的所述部分包含PKD1结构域的至少一部分、PKD2结构域的至少一部分、PKD3结构域的至少一部分、PKD4结构域的至少一部分、PKD5结构域的至少一部分、或它们的任意组合。
15.一种病毒颗粒，所述病毒颗粒与至少一种根据权利要求1至14中任一项所述的经分离的多肽或病毒衔接子分子共价结合。
16.根据权利要求15所述的病毒颗粒，其中病毒是腺相关病毒，任选地其中所述腺相关病毒选自由以下项组成的列表：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.74。
17.根据权利要求15至16中任一项所述的病毒颗粒，其中所述腺相关病毒颗粒包含在所述衣壳蛋白中的、介导与非蛋白结合物的相互作用的一个或多个氨基酸改变，所述非蛋白结合物诸如为硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)、O-连接唾液酸、N-连接唾液酸、N-连接半乳糖。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求15至17中任一项所述的病毒颗粒。
19.一种共价修饰病毒颗粒的方法，所述方法包括：
20.一种共价修饰病毒颗粒的方法，所述方法包括：
21.根据权利要求19或权利要求20所述的共价修饰病毒颗粒的方法，其中所述方法进一步包括将一个或多个异源半胱氨酸残基、例如1个、2个或3个异源半胱氨酸残基引入到所述经分离的多肽或病毒衔接子分子。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的共价修饰病毒颗粒的方法，其中所述经分离的多肽或病毒衔接子分子与所述病...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种经分离的多肽，所述经分离的多肽包含能够与病毒衣壳共价结合的一个或多个半胱氨酸残基。
2.一种病毒衔接子分子，所述病毒衔接子分子包含：(i)经分离的多肽，所述经分离的多肽包含能够与病毒衣壳共价结合的一个或多个半胱氨酸残基；以及(ii)配体。
3.根据权利要求1所述的经分离的多肽，其中能够与病毒衣壳共价结合的所述一个或多个半胱氨酸残基与所述经分离的多肽是异源的。
4.根据权利要求2所述的病毒衔接子分子，所述病毒衔接子分子包含：(i)经分离的多肽，所述经分离的多肽包含能够与病毒衣壳共价结合的一个或多个半胱氨酸残基；以及(ii)配体，其中所述一个或多个半胱氨酸残基与所述经分离的多肽是异源的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子能够与未修饰的野生型病毒衣壳结合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子能够与相较于野生型病毒衣壳具有5个或更少个(例如，5个、4个、3个、2个或1个)氨基酸点突变的病毒衣壳结合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子能够与相对于野生型病毒衣壳具有不超过5个氨基酸(即，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸)的氨基酸插入或缺失的病毒衣壳结合。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子能够与相对于野生型病毒衣壳不具有插入或缺失的病毒衣壳结合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述经分离的多肽或病毒衔接子分子包含具有一个或多个半胱氨酸残基并且能够与腺相关病毒衣壳共价结合的腺相关病毒受体(aavr，kiaa0319l)的一部分。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子包含柯萨奇病毒-腺病毒受体(cxadr)的一部分，任选地其中cxadr序列是seq id no:20。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子包含中和抗体a20的抗原结合部分。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的经分离的多肽或共价结合病毒衔接子分子，其中所述配体能够与细胞表面分子结合。
13.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·G·罗德里克斯，D·塞维提尼，B·苏达尔善，
申请(专利权)人：弗朗西斯克里克研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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