制备多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途技术

本发明专利技术提供了一种高效诱导多潜能干细胞的方法。利用慢病毒载体将Ｏｃｔ４（ＰＯＵ５ｆ１），Ｓｏｘ２，ｃ－Ｍｙｃ，Ｋｌｆ４，ＵＴＦ１，Ｒｅｘ１（ＺＦＰ４２）等６个诱导因子及ｐ５３基因抑制剂导入到细胞中，能高效诱导产生诱导多潜能干细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种诱导多潜能干细胞的方法，试剂盒及用途。
技术介绍
(一) 干细胞多能性(pluripotency)的特点 胚胎干细胞因为具有向三个胚层细胞的分化能力而被称为多潜能干细胞，此外，胚胎瘤(EC)细胞和胚胎生殖(EG)细胞均具有和胚胎 干细胞类似的多能性。多潜能干细胞共同的特点是细胞核质比比较大， 克隆样生长(人胚胎干细胞较扁平，而小鼠胚胎干细胞较为隆起，细胞界 限不明显)，具有AP酶活性，特异地表达SSEA4,TRA1-60,TRA1-81等表 面标志(小鼠胚胎干细胞还特异性地表达SSEA1 ,而人胚胎干细胞不表达 SSEA1 )，及Oct4, Nanog， Sox2, rexl(ZFP42),GDF3,lin28, mbd2， TEGF1等 标志性基因。此外，还可以在悬浮培养条件下，形成胚胎小体(Embryonid bodies)结构，并发生自发分化，EB形成6-9天后贴壁培养，可检测到向 内、中、外三个胚层分化的细胞。(二) 诱导多能性干细胞(IPS细胞)的研究2006年8月，日本京都大学再生医科学研究所教授山中伸弥 (Yamanaka)实验室首先宣布在小鼠的成纤维细胞中导入4个基因(Oct4, Sox2, c-Myc和KLF4)成功地将其诱导成为全能性的干细胞，其性质和胚 胎干细胞类似。'从而首次揭示了通过转基因可以在分化的细胞中建立全 能性。这是对许多年来的生物学观念的一次巨大的冲击，并且有望使基于 干细胞技术的治疗性克隆彻底摆脱卵子来源的困境和破坏胚胎引起的伦 理争议。目前使用这种人工干细胞来进行细胞治疗患者尚存在安全隐患， 但它不久后可能被应用于疾病模型的制作和新药研发等研究工作。这一成 果加快了再生医学的研究步伐，具有划时代的意义。等人首先选取了和小鼠胚胎干细胞自我更新及维持多能性相关的24个基因，分别将他们克隆到逆转录病毒载体，对胚胎成纤维细胞进行共转染，在进行基于Fbxl5报告体系的筛选之后，他们观察到了 ES-like的细胞集落的形成。经过对这24个基因的进一步分析，他们发现，仅转导Oct4, Sox2,c-Myc，KLF4就可以使胚胎成纤维细胞完全转变成为诱导的多潜能干细胞(IPS细胞-Induced Pluripotent Stem Cells,俗称诱导的多潜能干细胞)。该IPS细胞拥有正常的核型，表达类似胚胎干细胞的分子标志，可以在体外被诱导分化为内、中、外三个胚层的终末分化的细胞，能够在裸鼠体内形成畸胎瘤，在畸胎瘤中含有内、中、外三个胚层的分化细胞。此外，和胚胎干细胞一样，IPS细胞在Nanog和Oct4 promoter上检测到H3的低甲基化和高乙酰化。然而，采用Fbxl5基因作为reporter筛选出来的细胞并不具有完整的全能性，如内源Oct4等干性基因仍然没有能够正常地启动表达，不能通过囊胚注射的方法制成嵌合小鼠等。此后，2007年5月份，Yamanaka实验室和Jaenisch实验室同时在Nature杂志上发表文章声明2，3，他们采用新的报告基因(基于Oct4或nanog的promoter)进行抗药性筛选可以产生完全重编程的IPS细胞，新的IPS细胞可以使内源基因重新启动，并且可以通过囊胚注射制备成为嵌合小鼠，并整合到生殖系统中，产生完全由该IPS细胞生成的后代小鼠。Jaenisch实验室的实验结果表明，该IPS细胞甚至通过四倍体胚胎嵌合技术制备发育正常的小鼠胚胎。此外，新的IPS细胞的Oct4启动子及Nanog启动子的甲基化修饰也几乎被完全擦除。同时，Hochedlinger实验室和Plath实验室合作在Cell stem cells上发表文章，用更加丰富的手段验证了 IPS细胞完全重编程的效果。4例如，同分化细胞融合使分化细胞去分化的能力，雌性细胞的X染色体失活现象，H3K4和H3K27的甲基化谱等等。由此，4个因子诱导分化细胞成为全能性干细胞的事实被完全确认！2007年8月，Jaenisch实验室又发表新文章表明不需要任何筛选体系，只通过形态判断一样可以获得重编程完全的全能性细胞系。5如果靶细胞整合有GFP的报告体系的话，可以看到内源Oct4的启动，但其发生的时间较晚，大约在20-30天左右才可以观察到。也表明靶细胞需要一个较长的时间去逐渐发生重编程向IPS细胞的转变。同年9月，Ramalho-Santos实验室也在Cdl stem cdl杂志上发表文章称不用任何筛选体系即可完成IPS细胞的诱导。6此外，也有一些文章对四个因子进行了进一步分析，例如，上述Cellstem cell杂志的文章中，作者采用N-myc代替c-Myc来完成重编程，Yamanaka实验室和Jaenisch实验室也分别在Cell stem cell禾B NatureBiotechnology上发表文章声称不使用c-Myc，而只用Oct4,Sox2和KLF4一样可以获得IPS细胞，7 Yamanaka实验室甚至对于其它各因子都尝试了替换，如成功将Sox2换成Soxl和Sox3，成功将Klf4换成Klf2和Klf5，以及将c-Myc换成了 L-myc和N-myc。然而，不采用c-Myc以后，诱导IPS细胞的效率将会大大降低，也并非每次都可以重复，证明c-Myc对于reprogramming仍然起到了非常关键的作用。尽管诱导IPS细胞的技术研究发展迅速，诱导IPS细胞机制的分析却发展较为缓慢，Yamanaka曾在第一篇IPS细胞的文献中提出模型由c-Myc打开分化细胞的染色体结构，使之较容易被改造；而KLF4通过P53信号通路同c-Myc相互平衡，抑制由c-Myc带来的细胞凋亡；而Oct4和Sox2成为一对蛋白复合物，启动一系列和全能性相关基因，并抑制许多和分化发育相关基因的表达，从而使细胞转换到全能性的转态。此后，2008年2月和2008年3月的Cell stem cell杂志上分别发表两篇文章^揭示了诱导IPS重编程的变化过程。其中，Jeanisch实验室利用胚胎干细胞的四种标志AP活性的出观、sseal的表达、Nanog和Oct4等内源干性基因的启动，将IPS的诱导过程分为3个阶段。IPS的诱导时间大约在30天左右，其中AP活性最先出现，随时间增加，AP活性细胞比例逐渐增加至80。％以上；sseal在第9天左右开始表达，至iPS出现时，只有15%左右的细胞表达sseal; Nanog和Oct4在第16天左右出现，比例极低。与此同时，Hochedlinger实验室的工作也类似地将iPS的诱导过程分为Thyl的沉默，SSEA-1的表达，外源基因的沉默，内源干性基因的表达四个阶段。这些结果为进一步深入研究分子机制提供了很好的基础。也为IPS重编程技术的研究提供了阶段性指标。此外，Yamanaka在2008年2月的Science杂志中发表文章，报道了使用新的细胞类型——小鼠的肝细胞和胃细胞成功地实现了诱导IPS细胞重编程的过程。有趣的是，用肝细胞诱导IPS细胞对于基因整合的数量需求更少，而且对c-Myc基因的需求更小，和小鼠皮肤成纤维细胞相比，有更容易被诱导成为IPS细胞的趋势。另外，Yamanaka实验室的该论文中还使用细胞世系追踪的经典实验体系追踪了原代培养的肝本文档来自技高网...

【技术保护点】
诱导因子ＵＴＦ１，Ｒｅｘ１（ＺＦＰ４２）和ｐ５３基因抑制剂的至少一种用于诱导多潜能干细胞产生的用途。

【技术特征摘要】
1.诱导因子UTF1，Rex1(ZFP42)和p53基因抑制剂的至少一种用于诱导多潜能干细胞产生的用途。2. 诱导因子UTF1， Rexl(ZFP42)和p53基因抑制剂的至少一种用于促进诱导产生多能性干细胞的效率的用途。3. —种制备诱导多潜能干细胞的方法，包括向分化的细胞中提供诱 导因子，所述诱导因子包括Oct4(POU5fl)， Sox2， c-Myc和Klf4，以及 UTF1 ， Rexl(ZFP42)和p53基因抑制剂的至少一种。4. 权利要求3的方法，其中所述诱导因子不包括Oct4(POU5fl)， Sox2 ， c-Myc和Klf4中的 一种。5. 权利要求4的方法，其中诱导因子包括UTF1时不包括Oct4;诱 导因子包括p53si时不包括KLF4。6. 权利要求5的方法，其中诱导因子不包括c-Myc。7. 权利要求6的方法，其中所述分化的细胞是成纤维细胞，肝细胞， 胃细胞，角质细胞或血液细胞。8. 权利要求7的方法，其中所述分化的细胞来源于哺乳动物。9. 权利要求8的方法，其中所述哺乳动物是人、鼠或灵长类动物。10. 权利要求3-9任一项的方法，其中所述诱导因子...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓宏魁，赵扬，尹晓磊，张蔷，朱芳芳，刘海松，杨炜烽，向晨罡，秦汉，曲秀霞，
申请(专利权)人：北京大学，博科有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]